MÉTODOS DE

CUANTIFICACIÓN,
CROMATOGRAFÍA DE
GASES, CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA Y
ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
 MÉTODOS DE
CUANTIFICACIÓN Límite de cuantificación
Concentración mínima de un analito que
puede ser cuantificada en una matriz real, la
cual es tratada siguiendo todas las etapas del
Precisión método empleado, produciendo una señal Linealidad
cuantificable con una nivel de confianza Corresponde al
Grado de definido.
concordancia de un intervalo de
grupo de resultados concentración más
entre sí. Dispersión de fiable de medida para
estos resultados la determinación
alrededor de su media. analítica del analito.
Validación
Establece por medio de estudios científicos,
que un método tiene las características de
Replicabilidad desempeño que son adecuadas para
Repetibilidad cumplir los requerimientos de las
Reproducibilidad
aplicaciones analíticas pretendidas.

Exactitud
Expresa la cercanía entre el
valor que es aceptado, como
un valor de referencia
(material de referencia
certificado) y el valor
encontrado (valor promedio)
obtenido al aplicar el
procedimiento de análisis un
cierto número de veces.
Determinada en error.
Especificidad
Intervalo de valores en
Límite de detección que puede encontrarse
Basado en el cociente entre la magnitud de la un resultado, una
señal de la medida y el ruido de fondo
media de los mismos y
producido por el instrumento o por el blanco
analítico. el valor considerado
verdadero.
IUPAC
Instrumental
Método
VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO
• Etapas para desarrollar un
método analítico
1) Búsqueda bibliográfica
2) Definir condiciones
- Equipo
-Reactivos
-Muestreo
3) Estandarizar el método
-Encontrar las
condiciones óptimas
4) Validación del método
La validación de procedimientos
analíticos requiere: „
Instrumentos calificados y
calibrados.
Métodos documentados.
Patrones de referencia
confiables.
Analistas calificados.
Integridad de la muestra
La validación de un método
analítico representa parámetros
que nos permite obtener
resultados más confiables.
¿QUÉ ES LA
CROMATOGRAFÍA?
• Es un método físico de separación en
el cual los componentes a ser
separados son distribuidos entre dos
fases, una de las cuales es
estacionaria mientras la otra se
mueve en una dirección definida.
• Es clasificada por su utilidad y
en base al material que se
utilice como eluyente para
separar los solutos.
• De acuerdo a su utilidad la
cromatografía se clasifica en:
analítica, utilizada para
determinar los químicos
presentes en una mezcla y en que
concentración; y preparativa,
utilizada para purificar grandes
cantidades de químicos.
• Además tenemos:
Cromatografía de columna
Cromatografía de papel
Cromatografía de capa fina
Cromatografía líquida de alta
resolución
Cromatografía de gases
CROMATOGRAFÍA DE
GASES
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Principio
fisicoquímico)
• Es una técnica analítica que puede ser utilizada
para separar compuestos orgánicos basada en
sus volatilidades. También provee información
cualitativa y cuantitativa de los componentes
presentes en una mezcla. Los componentes son
separados por sus diferencias de partición
entre la fase móvil gaseosa y la fase
estacionaria en la columna, permitiendo que
sean separados en tiempo y espacio.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Principio
fisicoquímico)
• Existen dos tipos de cromatografía de gases:
• La cromatografía gas - líquido tiene gran aplicación en todos los
campos de la ciencia y su denominación se abrevia
normalmente como cromatografía de gases (GC). La
cromatografía gas - líquido se basa en la distribución del analito
entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada
sobre la superficie de un sólido inerte.
• La cromatografía gas - sólido se basa en una fase estacionaria
sólida en la cual se produce la retención de los analitos como
consecuencia de la adsorción física. Aplicación limitada debido
a la retención semipermanente de las moléculas activas o
polares y a la obtención de picos de elución con colas (una
consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de
modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación
excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo
peso molecular.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
Cromatógrafo)
• Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos
básicos ensamblados para:
1) Proporcionar un gasto o flujo constante del gas
transportador (fase móvil).
2) Permitir la introducción de vapores de la muestra en la
corriente de gas que fluye.
3) Contener la longitud apropiada de fase estacionaria.
4) Mantener la columna a la temperatura apropiada (o la
secuencia del programa de temperatura).
5) Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen
de la columna.
6) Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la
cantidad de cada componente.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
Cromatógrafo)
Un cromatógrafo de
gases consiste de:
1. Fase móvil.
2. Puerto de
inyección.
3. Horno de la
columna.
4. Columnas
5. Fase estacionaria.
6. Detector.
7. Sistema de
registro de datos
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
Cromatógrafo)

1) Fase móvil (mobile phases)

Gaseosa, líquida o fluido supercrítico (potencia disolvente de los fluidos
a temperaturas y presiones superiores al punto crítico). Estas fases son
generalmente gases inertes como Helio, Argón o Nitrógeno.
2) Puerto de inyección (inyection port)
Es un dispositivo que permite la introducción de la muestra en la
corriente del gas portador.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
Cromatógrafo)
3) Horno de la columna
En el interior se sitúa la columna, donde
se debe tener una buena regulación de la
temperatura. Dentro del horno la columna
se conecta en un extremo al puerto de
inyección, y en el otro al detector. La
columna debe estar en el centro del horno
sin tener contacto con las paredes.

4) Fase estacionaria (stacionary phase)

Es la encargada de separar los componentes de la muestra. Esta puede ser un
sólido o un líquido, dispuestos sobre un sólido que actúa como soporte
(columna). El sólido de la fase estacionaria puede ser de aluminio, sílica gel,
carbón o tierra de diatomeas; y el líquido de la fase estacionaria debe tener una
baja viscosidad y una alta y diferencial solubilidad.
5) Soporte (Support)
Sostener la fase estacionaria. El soporte debe de tener elevada superficie por
unidad de volumen, estabilidad térmica, dureza mecánica, inactividad química
y baja resistencia al paso de un gas.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
Cromatógrafo)
6) Columna cromatográfica
Las columnas están hechas de
cobre, acero inoxidable o tubos de
vidrio, dobladas o enrrolladas.
Excepto para las de vidrio, las
columnas son empacadas mientras
se están doblando. Las columnas
analíticas tienen una longitud de 1-6
m. de longitud y de 2-4 mm. de
diámetro.
7) Detectores
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la
corriente del gas acarreador, convirtiendo una señal no medible
directamente en una señal elaborable de una propiedad física. Esta señal
es elaborada por una comparación entre el gas acarreador puro (blanco)
y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente
separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es
amplificada y registrada al momento de salir de la columna.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Equipo,
7) Detectores Cromatógrafo)
Un buen detector es altamente sensible
(sensibilidad), tiene una respuesta lineal
- Detector de
(linearidad) sobre un amplio rango de
concentración y es relativamente insensible a conductividad térmica
variaciones de flujo y temperatura (rango (TCD thermal
dinámico lineal). conductivity detector)
Pueden ser clasificados por: - Detector de ionización de
• Grado de selectividad: universales que flama (FID flame
responden a la mayoría de los solutos; específicos- ionization detector)
selectivos con respuesta a un grupo particular de - Detector fotométrico de
sustancias. flama (FPD flame
• Recuperación de la muestra: en referencia a si la photometric detector)
muestra es destruída o no. - Detector de captura de
• Modo de respuesta: dependientes de flujo de electrones (ECD electron
masa (cantidad de soluto independientemente de capture detector)
la cantidad de gas portador); dependientes de - Detector de
concentración (cantidad de soluto por unidad de
volumen de gas portador).
fotoionización (PID
photoionization GC
• Proceso de detección: ionización; óptico-
detector)
espectroscópico; electroquímico.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Condiciones de
trabajo)
A parte de la elección a utilizar, existen muy pocos parámetros
sobre los que se pueda influir a la hora de realizar una separación
en cromatografía de gases, sin embargo se tienen en cuenta:
1. Naturaleza y velocidad de gas portador, inerte en la separación,
dependerá de las necesidades del equipo y la rápidez del
análisis.
2. Temperatura de detector, debe ser siempre más elevada que la
máxima temperatura de tabajo.
3. Temperatura de inyección, suficientemente elevada como para
volatilizar completamente todos los componentes de la muestra.
4. Temperatura de columna, cuando se trabaja en condiciones
isotermas genera influencia en la separación en conjunto con el
programa de calentamiento.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Análisis
cualitativo)
La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos
de separación más eficaces que se conocen; cada
componente de una muestra suministra tres unidades
de información: posición, altura y anchura de los picos
en el cromatograma.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Análisis
cualitativo)
Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio
de pureza de compuestos orgánicos. Los contaminantes,
si están presentes, se manifiestan por la aparición de
picos adicionales; las áreas de estos picos proporcionan
una estimación aproximada del grado de contaminación.
La técnica también es útil para evaluar la efectividad de
los procedimientos de purificación.
La cromatografla de gases es un medio excelente para
confirmar la presencia o ausencia de un supuesto
componente en una mezcla, siempre que se disponga de
un patrón.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Análisis
cualitativo)
• Análisis cuantitativo general de mezclas multicomponentes de
orgánicos volátiles.
• Técnica de separación muy eficiente.
• Fenómeno molecular: Reparto entre una fase de vapor y el substrato.
• Ventajas en el análisis cualitativo: Separa materiales para su examen
por medio de otras técnicas.
• Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los materiales
volátiles, análisis de multicomponentes, alta sensibilidad en casos
especiales.
• Muestra promedio deseable: 1 mg.
• Limitaciones del método: Identifica los materiales solo en casos
especiales.
• Limitaciones para la muestra: Presión de vapor mayor de 1 torr. a la
temperatura de entrada de la muestra
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Análisis
cualitativo)
Métodos de coincidencia
El método más simple de identificación cromatográfica consiste en
comparar el volumen de retención de un compuesto problema con el de
un patrón, determinado en las mismas condiciones operativas y en la
misma columna.
Retención relativa
Los volúmenes de retención dependen de un gran número de variables
operativas, debido a esto es difícil conseguir respuesta idéntica aún en
columnas preparadas en las mismas condiciones; por lo tanto, para
identificar sustancias a partir de datos bibliográficos se han de expresar
las retenciones como variables reproducibles por diferentes equipos e
investigadores.
Se han utilizado dos procedimientos generales: a) Cálculo de los
volúmenes de retención específicos b) Determinación de retenciones
relativas a patrones.
 CROMATOGRAFÍA DE
GASES (Análisis
cuantitativo)
La señal del detector de una columna cromatográfica gas-
líquido se ha utilizado generalmente para análisis
cuantitativos y semicuantitativos. En condiciones
cuidadosamente controladas se consigue una exactitud
(relativa) del 1 %. Como con la mayoría de los
instrumentos analíticos, la fiabilidad se relaciona
directamente con el control de las variables; la exactitud
también depende en parte de la naturaleza de la muestra.
La discusión general del análisis cuantitativo
cromatográfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la
cromatografia de gases como a otros tipos; por esta razón
no se hacen aquí más consideraciones sobre este aspecto.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Principio
fisicoquímico)
• Es una técnica de permite separar, aislar e
identificar los analitos de una mezcla de
compuestos químicos (basada en la
transferencia de masa entre la fase estacionaria
y la fase móvil), por lo que es utilizada
frecuentemente en bioquímica y química
analítica para la separación de componentes de
una sustancia determinada, basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Principio
fisicoquímico)
• La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en
una columna generalmente de vidrio, la cual está
rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en
la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de
la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de
aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño
de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta
el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad
de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase
móvil. De esta manera, nació la técnica de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar
con las altas presiones requeridas.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Carácterísticas)
• La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla.
Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y
una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha
tratado con RMe2SiCl.
• La fase móvil actúa de portador de la muestra. La
muestra en solución es inyectada en la fase móvil.
• Los componentes de la solución emigran de acuerdo a
las interacciones no-covalentes de los compuestos con la
columna. Estas interacciones químicas, determinan la
separación de los contenidos en la muestra.
• La utilización de los diferentes detectores dependerá de
la naturaleza de los compuestos a determinar.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Características)
• Aplicaciones principales: Técnica de separación para los
materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de
multicomponentes.
• Fenómeno molecular: Reparto entre una solución líquida y
un substrato.
• Ventajas en el análisis cualitativo: Separa materiales para su
examen por medio de otras técnicas.
• Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los
materiales menos volátiles, análisis de multicomponentes.
• Muestra promedio deseable: 10 mg.
• Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método.
• Limitaciones para la muestra: Ninguna
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Carácterísticas)
• Las razones de la popularidad de
esta técnica son su sensibilidad, Ensanchamiento de zona
su fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la
separación de especies no
volátiles o termolábiles y, sobre
todo, su gran aplicabilidad a
sustancias que son de primordial 1. Efectos del tamaño de
interés en la industria, en muchos partícula del relleno.
campos de la ciencia y para la 2. Ensanchamiento de banda
sociedad en general. extracolumna en
cromatografía de líquidos.
3. Efecto del tamaño de
Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, muestra en la eficacia de
hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, la columna.
plaguicidas, antibióticos esteroides, especies
organometálicas y una cierta variedad de sustancias
inorgánicas.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Equipo)
• El equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que
el que se utiliza en otros tipos de cromatografía.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Cromatograma)
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) (Equipo)
1) Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes
En ésta cromatografía se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero
inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Por lo
general se equipa con un sistema para eliminar los gases disueltos que pueden
generar una interferencia.
2) Sistemas de bombeo
Generación de presiones por encima de 400 kg/cm2, flujo libre de pulsaciones,
intervalo de caudal de 0,1 a 10 mL/min, control y reproducibilidad del caudal, y
compontes resistentes a la corrosión.
3) Sistemas de inyección de la muestra
Volúmenes pequeños, en orden micro litros (μL)
4) Columnas para cromatografía de líquidos
Tubos rectos de acero inoxidable, longitud entre 10 y 30 cm, acoplables, diametro
interno de 4 y 10 mm y tamaño de partícula entre 5 y 10 um.
5) Detectores
No hay detectores aplicables universalmente.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
(Condiciones de trabajo -
Parámetros)
Diámetro interno de la columna Es un aspecto crítico que influye en
la sensibilidad de la detección y la selectividad de separación en
gradiente de elución.
Medida de las partículas Fase estacionaria unida al exterior de
partículas esféricas de sílica, con diferentes medidas siendo las de 5um
de diámetro más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una
mayor superficie y una mayor separación.
Tamaño de poro Las fases estacionarias son porosas para proporcionar
una mayor superficie, mientras los poros de mayor medida
proporcionan una mejor cinética (proteínas).
Presión del sistema El rendimiento se mide en su capacidad para
producir una velocidad de flujo constante y reproducible.
ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
(Principio fisicoquímico)

• La espectrometría de masas está basada en

la obtención de iones a partir de moléculas
orgánicas en fase gaseosa; una vez
obtenidos estos iones, se separan de
acuerdo con su masa y su carga, y
finalmente se detectan por medio de un
dispositivo adecuado.
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
(Principio fisicoquímico)
• Un espectro de masas será, en
consecuencia, una • La información
información bidimensional ofrecida por un
que representa un parámetro espectro de masas es,
relacionado con la abundancia de alguna forma,
de los diferentes tipos de comparable a la
iones en función de la relación obtenida mediante una
masa/carga de cada uno de
ellos.
gran cantidad de
reacciones de las
• La presencia y abundancia en
el espectro de determinados
utilizadas para la
tipos de iones, identificables a determinación de
partir de su masa, será estructuras por vía
función de la estructura química.
química de cada compuesto. Información de la estructura química
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS 3. Capaz de
1. Capaz de
vaporizar
(Equipo) separar los
iones en función
substancias de de su relación
masa/carga.
volatilidades
ESPECTROMÉTRO
muy diferentes.

2. Capaz de
originar iones a 4. Capaz de
partir de las detectar los iones
moleculas neutras formados y
en fase gaseosa. registrar la
información
adecuadamente.
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
(Equipo)

1)Sistema de introducción de muestras

La condición necesaria para que se pueda obtener el espectro de un compuesto, es que su
presión de vapor sea igual o superior a 10-6 mm de mercurio, a una temperatura tal que la
muestra no pirolice; para poder realizar el espectro, no es necesario vaporizar toda la
muestra, sino únicamente la cantidad necesaria para alcanzar la presión indicada
anteriormente.
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
2) Fuente de iones
(Equipo)
Principalmente, existen dos métodos para producir la ionización de la muestra en estado
gaseoso; la ionización por impacto o bombardeo electrónico, que es con mucho el más
utilizado, y la ionización química.
• Ionización por impacto electrónico. En este método, las moléculas de muestra son ionizadas
por medio de un haz de electrones de elevada energía.
• Método de Ionización Química. En este método, se utiliza como agente ionizante un ion que va
a transferir su carga a la molécula de muestra por medio de una reacción bimolecular.
3)Analizador, para la separación de iones
Los analizadores más utilizados, son el de campo magnético, el analizador cuadrupolar, muy
utilizado en equipos combinados con un cromatografo de gases, y el analizador de trampa de
iones.
4)Sistema detector y registrador
Existen principalmente tres tipos de detectores:
- Caja de Faraday placa, ligeramente inclinada para evitar la reflexión de iones.
- Multiplicador de electrones esencialmente igual a los tubos fotomultiplicadores utilizados para
la detección de radiación.
- Placa fotografica es necesaria una altísima sensibilidad o una extraordinaria resolución.
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
(Aplicaciones cualitativas)
• Determinación del peso molecular de todas las sustancias que
pueden volatilizarse por la posición del pico correspondiente a
la masa patrón.
• Determinación de la formula molecular. Si el instrumento es de
gran resolución bastará la determinación precisa de su masa
molecular para poder atribuirle una fórmula empírica.
• Identificación de compuestos por su fragmentación patrón: la
fragmentación de la mayor parte de las moléculas produce un
gran número de picos que permiten la identificación de
numerosos compuestos y el reconocimiento de ciertos grupos
funcionales de ellos.
• Caracterización y análisis de polímeros: el polímero se piroliza
en condiciones controladas y los productos volátiles se hacen
pasar a un espectrómetro para su análisis.
 ESPECTROMETRÍA DE
MASAS
(Aplicaciones
cuantitativas)
Determinación cuantitativa de especies moleculares o
tipos de especies moleculares en muestras orgánicas,
biológicas y ocasionalmente inorgánicas: normalmente
tales análisis se llevan a cabo haciendo pasar la muestra
a través de una columna cromatrográfica o de
electroforesis capilar y posteriormente por el
espectrómetro.
Determinación de la concentración de elementos en
muestras inorgánicas y, en menor medida, de muestras
orgánicas y biológicas: las concentraciones de analito en
este caso se obtienen directamente a partir de las alturas
de los picos de los espectros de masas.
 REFERENCIAS
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www.academia.edu/6932417/VALIDACI%C3%93N_DE_M%C3%89TODOS_ANAL
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terapéutica de metotrexato en pacientes leucémicos mediante cromatografía líquida de alta
resolución. Desarrollo, validación y aplicación clínica del método analítico. Recuperado de
https://biblio.uptc.edu.co:2057/science/article/pii/S1888400817301101
• MALDONADO, W. NOGUERA, K. OLIVERO, J. (2013). Caracterización por cromatografía
de gases-espectrometría de masas del thinner comercialmente disponible en la ciudad de