Medios de cultivo

Objetivo: Analizar los medios de cultivo que se utilizan

mayormente en la microbiología agroindustrial.
Definiciones.
• Medio de cultivo. Es cualquier sustancia nutritiva, sólida o líquida, que
pueda ser utilizada en el laboratorio para el crecimiento de
microorganismos, adicionada o no de substancias enriquecedoras,
selectivas, indicadoras y tamponantes.

• Agar. Medio de cultivo sólido con un contenido de agar-agar mayor

del 1 %.
• Caldo. Es un medio de cultivo líquido, exento de agar.
1.- MEDIOS DE CULTIVO

• SOLUCIONES CON NUTRIENTES.

• UTILIDAD: crecimiento bacteriano

•Estudio de las características

•Presencia o ausencia de bacterias

• LOS MEDIOS NECESITAN ADEMÁS CONDICIONES FISICO- QUÍMICAS

Y AMBIENTALES CONCRETAS
2.- FUNCIONES DE LOS MEDIOS

• Separar y aislar especies microbianas

• Identificación de especies microbianas
• Conocer el metabolismo de los microorganismos.
• Estudios macroscópicos (colonias y UFC)
• Conservar especies microbianas.
• Realización de antibiogramas.
• Realización de pruebas de CMI (concentración mínima inhibitoria)
para antibióticos.
Clasificación de los medios de cultivo.

• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de

origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la
adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes ni las cantidades exactas presentes.

• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición
química definida cuali y cuantitativamente.
Clasificación de los medios de cultivo.
De acuerdo al uso del medio de cultivo:
• Medios de enriquecimiento:
 Favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten
aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Contienen una o más sustancias
inhibidoras del crecimiento de los microorganismos.

• Medios selectivos o inhibitorios:

 Medios sólidos, diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos: Ej.

agar-antibióticos; para algas, medios con NaCl superior a la concentración fisiológica .

• Medios diferenciales:

 Contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los

microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana.
Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos: Ej. azúcar
fermentable: lactosa, indicador:rojo neutro
Medios de cultivos

Clasificación de medios de cultivo:

1.Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos.

2.Según su finalidad en microbiología:

No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el
crecimiento de gran variedad de microorganismos.

Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de microorganismo.

Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser

sangre, suero, albúmina, etc... Para microorganismos exigentes.

Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias

entre diferentes tipos microorganismos.
 Control de calidad del agua destilada

Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua

destilada que haya sido sometida a controles periódicos que aseguren su calidad.

Controles periódicos:
Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminación microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
Medio de cultivo:
Parámetros a tener en cuenta para
obtener un buen resultado.
Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte.

pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o

1M CLH

fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.

15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.

Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar.

Incubación: las pilas de platos < 6.

Medios listos para su uso:

Todos los medios y diluyentes que se suministren en una

forma directamente utilizable o parcialmente completa deben
ser validados antes de su utilización.

Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a:

 la recuperación o supervivencia de los microorganismos de
interés
 la inhibición o supresión de los microorganismos no deseados
tiene que ser cuantitativa.
 los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y
bioquímicas).

Parte de esa validación es provista por las especificaciones de

calidad del proveedor.
Control de esterilidad
de los medios de cultivo y diluyentes:

¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios de

cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.

• La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se

corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.

• Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del

comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o
distribuir los medios o diluyentes.

• Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un

lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se
esteriliza por filtración.
Recuento de células viables.
 Los medios de cultivo se preparan:

1. En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes.

2. A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.

Se puede tomar como base el documento

ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding stuff-General rules for
microbiological examinations para:
-La preparación y esterilización de medios.
-Tiempos de almacenamiento recomendados.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Pesada
2. Hidratación
3. Ajuste de pH
4. Distribución
5. Esterilización
6. Vertido
7. Enfriamiento
CONSERVACIÓN

• 4 – 6 semanas.
• Guardar a 4 º C
• Proteger de la luz
• Antes de su empleo, atemperar.
• Los medios para verter a placa se guardan en el frasco original.
• Los medios guardados en estado sólido, se refunden para su
distribución.
ELIMINACIÓN

• Se deben descontaminar tras la utilización.

• Posibilidades:
1. Inundación con solución desinfectante (de 12 a 24 horas)
2. Autoclave
3. Incineración
Organismos indicadores:

• Inocuidad: Que no causa daño a la salud.

Relacionado con salubridad, patógenos,
transmisión por alimentos.
• Organismos indicadores: microorganismos
propios o impropios o productos metabólicos
presentes en un alimento y que pueden
predecir el estado de calidad del mismo.
• http://www.who.int/topics/food_safety/es
Organismos indicadores: criterios.

• Presentes y detectables en alimentos

donde la calidad va a ser evaluada.
• Crecimiento y número en correlación
negativa directa con calidad de producto.
• Detectados y contados fácilmente.
• Diferenciables de otros organismos.
• Su crecimiento no debe ser perjudicado
por otros microorganismos.
 Algunos organismos relacionados con
calidad de producto.

Organismos. Productos.

Acetobacter sp. Sidra refrescante

Bacillus sp Masa de pan

Byssochlamys sp Frutas enlatadas

Clostridium sp Quesos duros

Esporas del agriado Hortalizas enlatadas

Bacterias acidolácticas Cervezas, vinos

Lactococcus lactis Leche fresca

Pseudomonas putrefaciens Mantequilla

 En la práctica se detectan ORGANISMOS INDICADORES
•Evalúan la calidad de un producto o predicen su durabilidad.
•Asociados al tracto intestinal.
•Su presencia en agua indica una alta probabilidad de que la
fuente estuvo en contacto con material de origen intestinal.

Organismos indicadores más usados:

GRUPO COLIFORMES: E. coli

Enterobacterias (algunas bacterias de este grupo no

están asociadas al intestino)
 Organismos indicadores: criterios
adicionales de inocuidad.

• Las bacterias deben demostrar especificidad,

encontrándose únicamente en el intestino.
• Deben encontrarse en cantidades elevadas
en heces presentes en diluciones
elevadas.
• Resistencia al medio externo.
• Detección fácil y confiable cantidades
pequeñas
COLIFORMES Totales Enterobacter, Citrobacter,
Serratia, Klebsiella

Fecales Escherichia coli (algunas

cepas), Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
spp.
Crecimiento entre 44°C-46°C.

OTROS INDICADORES Enterococcus faecalis

más resistente, soporta

condiciones extremas
mejor indicador
 ENTEROBACTERIAS
Características Bacilos Gram (-), aerobios facultativos
No mótiles o móviles por peritricos
Oxidasa (-) (los diferencia de Pseudomonas y
Aeromonas)
Con requerimientos nutricionales
simples
No esporulados / Brillo metálico
Fermentan azúcares (lactosa) y producen
ácido y gas.
Nitrato reducido sólo hasta Nitrito

Representantes Escherichia sp.

Salmonella sp.
Shigella sp.
Proteus sp.
Yersinia sp.
E. COLI (indicador
clásico)
Vive normalmente
en el intestino
del hombre y
animales de
sangre caliente

Se transmite
por agua y alimentos
contaminados

Cepas patógenas
enterotóxica,
enterohemorrágica
y
enteropatogénica

Diarrea en todos
los casos
ENTEROCOCOS

Se considera microflora
normal del tracto
digestivo e intestinal

Patógenos
oportunistas
causan infecciones
urogenitales

Muy resistentes a
condiciones
adversas (altas
concentraciones de
sales, resistencia a
antibióticos y
desinfectantes)
Salmonella

Se transmite
por alimentos y
agua
contaminada

Causa fiebre, diarrea

vómitos y dolor de
cabeza

Controlada fiebre
tifoidea, aumentos
en gastroenteritis
PSEUDOMONAS

De interés la especie
P. aeruginosa

Patógenos
oportunistas causan
infecciones diversas
(conjuntivitis, otitis,
alergias en la piel)

Pacientes inmuno-
comprometidos

Resistente a la
mayoría de los desinfectantes y antibióticos (eficiente cloración)
Organismos coliformes: criterios.

• Productos lácteos: higiene de la planta y

establos (no usada para contaminación fecal).
• Hortalizas blanqueadas congeladas: no
indicadores (Enterobacter asociado a suelos).
• Aves: presencia de Salmonella y
enterobacterias antes del sacrificio.
• Carnes: Organismos entericos psicotróficos y
Aeromonas sp. Coliformes: pruebas valiosas.
• Pescados: aguas de mar: calidad higiénica.
Table 20-3 Suggested Coliform/E coli Criteria

Indicator/Products Plan n c m M
1. Coliforms: Dried milk 3 5 1 10 102
2. Coliforms: Pasteurized liquid, frozen, and dried 3 5 2 10 103
egg products
3. Coliforms: Infants, children, and certain dietetic 3 5 2 10 102
foods; coated or filled, dried
shelf-stable biscuits
4. Coliforms: Dried and instant products requiring 3 5 1 10 102
reconstitution
5. Coliforms: Dried products requiring heating to 3 5 3 10 102
boiling before consumption
6. Coliforms: Cooked ready-to-eat crabmeat 3 5 2 500 5,000
7. Coliforms: Cooked ready-to-eat shrimp 3 5 2 100 103
8. E. coli: Fresh, frozen, cold-smoked fish; frozen 3 5 3 11 500
raw crustaceans
9. E. coli: Precooked breaded fish; frozen 3 5 2 11 500
cooked crustaceans
10. E. coli: Cooked, chilled, frozen crabmeat 3 5 1 11 500
11. E. coli: Frozen vegetables/fruits, pH >4.5; 3 5 2 102 103
dried vegetables
12. E. coli: Fresh/frozen bivalve mollusks 2 5 0 16 —
13. E. coli: Bottled water 2 500—
Note: Items 6 and 7 are recommendations of the National Advisory Committee on the Microbiological Criteria
for Foods, USDA/
FDA, January 1990, and the criteria noted are for process integrity. All other items are from ICMSF.33

n: n° de muestras; c: n° de defectuosas, m: limite, M: máximo posible para defectuosos.

 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LOS
ORGANISMOS INDICADORES

Filtración por membrana:

Muestras con poca cantidad de microorganismos

Límites: 0 ufc / 250 ml
Permite el procesamiento de grandes volúmenes

Número Más Probable (NMP):

Muestras con gran cantidad de microorganismos

Límites: 1000 / 100 ml
10.000 / 100 ml
FILTRACIÓN POR MEMBRANA

La muestra se procesa directamente

Se colocan membrana de poro diferencial:

Coliformes 0.45 µm
Enterococos y Pseudomonas 0.20 µm

Los microorganismos quedan sobre la membrana

Se coloca membrana en agar con nutrientes

Unidad de filtración

Colonias de coliformes
creciendo sobre agar
Número Más Probable

Se basa en probabilidades estadísticas

Baja precisión y reproducibilidad

La muestra debe ser diluida debido a la alta carga

de bacterias que presenta

Se deben sembrar réplicas de cada dilución

Triplicados (3 tubos)
Quintuplicados (5 tubos)
Para el método del NMP se realizan diluciones
seriadas de forma de garantizar un número
adecuado de bacterias
Se trabaja con 3 diluciones continuas
Se preparan 3-5 réplicas para cada dilución
Se reporta el número de tubos positivos para cada dilución
Se establece un código que es llevado a la tabla del NMP

1:10 5 NMP / ml

1:100 3

1:1000 1
 Técnicas especiales de recuento:

Petrifilm: Es un Método Microbiológico

LISTO PARA USAR de alta calidad, utilizado
por Laboratorios Microbiológicos e Industrias
Alimenticias que necesitan cubrir los riesgos
de seguridad.
Siembra y cultivo de microorganismos.
Siembra en placa Siembra en tubo

Diluciones.
SIEMBRA POR ESTRÍA
Comentarios Finales

El tratamiento de las aguas destinadas al consumo humano o

de aquellas que serán vertidas a sistemas de cuerpos de
aguas tiene gran relevancia sanitaria

Durante los últimos años, el desarrollo y aplicación de nuevas

tecnologías a nivel de los sistemas de tratamiento de aguas
destinadas al consumo humano ha contribuido notablemente
a evitar diversas enfermedades infecciosas
Con miras a garantizar la ausencia de agentes patógenos en el agua de
consumo y cumplir con las regulaciones sanitarias en los efluentes de
la planta de tratamiento de aguas residuales, es indispensable no
descuidar la correcta operación de los sistemas claves: floculación,
sedimentación, filtración y clorinación; así como tampoco, subestimar
la significancia de la presencia de los organismos indicadores durante
el control microbiológico que se aplica
 3.- Obtención de cultivos puros

3.1. Siembra por agotamiento

3.2. Diluciones seriadas y siembra en placa

0.1 ml 0.1 ml
 Técnica de siembra en superficie

1.: Colocar el inóculo en la placa de Petri 4: Extender el inóculo en la placa

2, 3: Esterilizar el asa de vidrio

Tarea.
Revisar la NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1 529-1:99

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. PREPARACIÓN DE

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.