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Retardo Tiempo de
Retención
Fase
estacionaria Composición de
Analito
fase móvil
Líquidos Orgánicos:
•Metanol
Agua •Acetonitrilo
Fase Móvil purificada
Sales y buffers:
•Contribuyen a la separación
de componentes
Gradiente de elución
Separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición
de la fase móvil.
Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación
de picos en el detector.
La información obtenida se analiza mediante una computadora acoplada al
equipo; permitiendo:
Estandarizar la cromatografía
Identificar la naturaleza los picos eluídos
Cuantificar su contenido.
Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que
permiten identificar los compuestos presentes en la mezcla. La cantidad
relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del
pico correspondiente.
Tipos de HPLC
FASE NORMAL
FASE REVERSA
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
INTERCAMBIO IÓNICO
FASE NORMAL Y FASE REVERSA
Cromatografía reparto
Polar No Polar
Una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros
puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.
Fase Estacionaria
Sílice
Hidrofílicas y porosas
Alúmina
Fase Estacionaria
Sílice: Alúmina:
Empleada como intercambiador
catiónico.
Es el más utilizado debido a que
Su neutralización y acidificación
retiene a los solutos por hace posible su empleo como
adsorción. intercambiador aniónico.
Muy estable, lo que permite gran Carácter anfotérico permite la
variedad de disolventes. determinación de solutos de
Capacidad para catalizar la carácter ácido y básico.
degradación de las moléculas del Deben evitarse los pH extremos,
soluto. que pueden llevar a la disolución
de la fase estacionaria.
Separación de sustancias
orgánicas no saturadas
Anillos bencénicos
Isómeros de anillos aromáticos
condensados
Disolventes
Elevada polaridad:
o Agua
o Trietilenglicol
Fase Móvil
Hexano
Isopropilenglicol
Tolueno
Diclorometano
Éter
Acetato de Etilo
FASE NORMAL
Ventajas Desventajas
Características
Características
Características
Polímeros
Rellenos de
columna
Sílice
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
SÍLICE
Ventajas:
Gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de
presiones más elevadas.
Mayor estabilidad, lo que permite gran variedad de disolventes
incluyendo el agua.
Una equilibración más rápida al cambiar el disolvente.
Buena estabilidad a elevadas temperaturas.
Desventajas:
Tendencia a retener solutos por adsorción.
Capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del
soluto.
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Utiliza disolventes
Filtración sobre gel acuosos y rellenos
hidrofílicos
Exclusión por
tamaño
Utiliza disolventes
Penetrabilidad orgánicos no
sobre gel polares y rellenos
hidrofóbicos
APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
xRSO3-H+ + B+ (RSO3-)x B+ + H+
Se aumentan las
diferencias de
conductividad entre los
iones de la muestra y los
iones del eluyente con
intercambiadores de baja
capacidad que hacen
posible la elución con
soluciones que contienen
bajas concentraciones del
electrolito.