BLOQUE: TÉCNICAS EXPERIMENTALES ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMA (ELISA)

Ensayo de inmunoabsorción
ligado a enzima (ELISA)
Claire Horlock, Imperial College London, Reino Unido
Traducción: Jesús Gil, Würzburg, DE (SEI)

El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA)

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es una técnica muy usada en inmunología para medir
anticuerpos, antígenos, proteínas y glicoproteínas en
muestras biológicas. Algunos ejemplos incluyen: diagnóstico
de infección por VIH, test de embarazo, y medición de
citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o
suero. Generalmente se llevan a cabo en placas de 96
pocillos, lo que permite medir múltiples muestras en un único
experimento. Estas placas deben tener propiedades
especiales (ser absorbentes, como las NUNC) para asegurar
que el anticuerpo o el antígeno se pegan a su superficie.
Cada prueba mide un antígeno específico, existiendo una
gran variedad de kits disponibles para distintos antígenos.
En la Figura 1 se puede observar un tipo de ELISA, llamado
ELISA sandwich, donde se utilizan dos juegos de
anticuerpos para detectar productos, como citocinas. El
método se lleva a cabo en el orden mostrado. El primer paso
es recubrir la placa ELISA con el anticuerpo de captura; Figura 1. Ensayo ELISA. Lo que se
cualquier anticuerpo en exceso o que no se haya unido se muestra es un ELISA tipo sandwich, con
elimina después mediante lavado. Este anticuerpo está los pasos de la prueba numerados del 1
diseñado para reconocer el antígeno de interés. al 4.
Después la muestra (ej. orina, suero o sobrenadante
celular) es añadida. Cualquier antígeno que se encuentre en
ella se unirá al anticuerpo de captura que recubre la placa.
Las muestras suelen añadirse en duplicado o triplicado (para
permitir análisis estadístico) y en distintas concentraciones
para garantizar que puedan ser medidos con los niveles de
detección de la prueba. De nuevo, cualquier excedente es
eliminado de la placa usando un paso de lavado.
En el último paso, se añade el anticuerpo de detección,
que suele estar marcado con una enzima, generalmente
peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Este Figura 2. Curva éstandar típica. Se
anticuerpo se unirá a los antígenos que estarán a su vez muestra una curva estandar para un
ELISA que detecta IFNγ. Para
unidos al anticuerpo de captura. Para terminar, se añade
determinar la concentración del
una solución substrato. Las pruebas ELISA suelen ser
antígeno en la muestra, la curva
cromógenas, es decir, se basan en una reacción que estandar se basa en usar una solución
convierte el sustrato (ej. TMB o ABTS) en un producto que contiene una concentración
coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas. conocida del antígeno.
Para determinar la concentración de antígeno en la muestra se requiere producir una curva
estandar, utilizando antígenos en concentración conocida (mostrado en la Figura 2). La
concentración del antígeno en la muestra se puede calcular utilizando la densidad óptica (OD).