CROMATOGRAFIA

Dra. Ximena Solano A.

 CONCEPTOS BASICOS
 La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes
que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en
reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en
una dirección definida.
 En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase
móvil, que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico.
 Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual
se mantienen fija en una columna o sobre una superficie sólida.
 Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
 Aquellos componentes que son retenidos con más fuerza por la fase estacionaria
se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia
de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas
discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente
CONCEPTOS BASICOS
 Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su
movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la separación
cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los
mismos.
CONCEPTOS BASICOS

 Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la

adsorción y la absorción.
1. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a
la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se
relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de la naturaleza
de la sustancia adsorbida, temperatura, naturaleza del adsorbente y
concentración.
2. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por
parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar
mezcla o reaccionar químicamente con la misma.
MECANISMOS

3. Tamaño Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser

separadas en virtud de su tamaño donde la fase estacionaria es un gel
hidrofilico altamente poroso que retiene las moléculas de menor tamaño
al de los poros.
4. Las moléculas de mayor tamaño son retardadas en su paso por pequeñas
fuerzas de adsorción de la superficie externa del gel que luego son
excluidas de la fase estacionaria.
5. Migración Eléctrica: Los componentes iónicos de una muestra son
separados por su diferente velocidad y sentido con que se desplazan en
un campo eléctrico. La fase estacionaria puede ser un papel saturado por
un electrolito. La aplicación de un campo provoca un movimiento
diferencial de los iones dependiendo de su carga y de su movilidad iónica.
CLASIFICACION
 Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos
1. según su fase móvil se clasifica en:
a) Cromatografía de gases que puede ser a través de dos sistemas, gas-
líquido y gas-sólido
b) Cromatografía líquida donde el eluyente es un líquido y puede ser líquido-
liquido, liquido-sólido
CLASIFICACION

2. Por el mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio

implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra;
a) Cromatografía de reparto
b) De adsorción
c) De exclusión..
CLASIFICACION
3. Según la forma de contacto entre las fases se denomina:
a) De columna
b) Superficie plana.
4. También se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la
dimensionalidad, escala física y gradientes
TERMINOLOGIA

 Analito, es la substancia que se va a separar durante la cromatorafía.

 Cromatografía analítica, se emplea para determinar la existencia y
posiblemente también la concentración de un analito en una muestra.
 Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a
las partículas de soporte o a las paredes internas de la columna.
 Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de
separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.
 TERMINOLOGIA
 Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por
ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
 Eluyente es la fase móvil que atraviesa la columna.
 Fase móvil, es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un
líquido)
 Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre
partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.
 Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito
particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta
el detector) bajo las condiciones fijadas.
 Capilaridad, propiedad de los líquidos de ascender a través de otro material,
depende de la tensión superficial del mismo
.
 TERMINOLOGIA
 La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la
posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal,
mide la retención de un componente.
 Se define como: RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del
eluyente desde el origen
 La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el
centro de la mancha
 los cálculos se simplifican si el denominador es 10.
 Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad
de muestra).
 El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF
entre 0.55 y 0.7.
CROMAOGRAFIA PLANA
 Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina”
o “en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte
plano y rígido.
ELECCION DEL ELUYENTE
 La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del
material en que la separación se lleva a cabo. Un método que se emplea para
la selección del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos
disolventes y unas muestras patrón.
 Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
 Éter de petróleo
 Éter dietílico
 Ciclohexano
 Acetato de etilo
 Tetracloruro de carbono†
 Piridina†
 Benceno†
 Etanol
 Cloroformo†
 Metanol
 Diclorometano
 Agua
 Ácido acético
ELECCION DEL ELUYENTE

 En la elección del eluyente influyen varios factores:

 Precio.
 Pureza.
 No utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las
proporciones de los disolventes que conformen la mezcla
(reproducibilidad).
 No utilizar compuestos muy volátiles.
 Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
 La elección del eluyente se realiza con el análisis de la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
 REVELADORES
 Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de
dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:
 Métodos químicos. Métodos físicos.
 Métodos químicos Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo
revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores.
 Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las
manchas aparecidas.
 Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con
los componentes orgánicos produciendo manchas negras.
 También es utilizado el permanganato potásico, que deja unas manchas de color
amarillo. El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de
componente separado.
 Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:
 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehídos y cetonas). Verde de bromocresol (para
ácidos carboxílicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina
(para aminoácidos).
REVELADORES

 Métodos físicos. El más común consiste en añadir al adsorbente un

indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una
lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de
onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
 Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de
ultravioleta.
 CROMAOGRAFIA PLANA
 Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada
componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente
de fase móvil.

Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D
 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
 F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de
longitud.
F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso
más) de longitud.

1. Muestra depositada sobre el lecho

cromatográfico
2. La muestra penetra en el lecho
3. Se añade fase móvil
4. Comienza la separación de los
componentes de la muestra
7. Eluye el primer componente
9. Eluye el segundo componente
 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
 Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de
Magnesio.
 La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda
soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o
vidrio.
 La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va
atravesando la fase estacionaria.
 La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por
nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de
la columna.
 La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se
encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales
que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria.
 Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda
total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la
columna.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
 Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas.
 La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede
ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido)
 O una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-
Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido).
 El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una
entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente
localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y
un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.
 La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la
columna que es el sitio donde ocurre la separación.
 CROMATOGRAFIA DE GASES

 La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase

estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es
generalmente de sílice.
 La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través
de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la
muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa.
 Al final de la columna existe el detector que permite la detección y
cuantificación de las sustancias, midiendo conductividad térmica y
electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo
eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un
integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los
componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatógrama en
forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.
CROMATOGRAMA
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
PRESION
 Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión
(entre 1500 a 2200 psi).
 La fase estacionaria, presenta tamaño de partícula de entre 3 y 10 micras,
 La longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo
sofisticado.
 Se pueden analizar muestras proteicas.
 La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la
columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando
por tanto la resolución
 El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una
bomba que inyecte el líquido a la columna.
 Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo
de líquido sea adecuado
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA

 La mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase

móvil
 El inyector permite la aplicación de la muestra.
 A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción
ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que
eluyen de la columna, se requiere un colector.
 En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar
la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su
contenido.
 Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que
permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla.
 La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la
curva del pico correspondiente.
HPLC
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

 (atención: es adsorción, no absorción)

 Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre
la superficie de un sólido activo. La adsorción es la capacidad de las
superficies para fijar moléculas.
 La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo,
fosfato cálcico, hidroxiapatito...
CROMATOGRAFIA DE REPARTO

 Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase

estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o diferentes
solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso
de la cromatografía líquida).
 Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados
a la celulosa (papel) o al soporte sólido que forma la capa fina; en
columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de sílice, celulosa en
polvo...
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO
 Diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la
muestra.
 ¿Qué significa intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por
ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga
opuesta.
 Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra (de ahí la palabra intercambio).
 Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del
disolvente (F.M.) o bien los de la muestra.
 Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente
a la F.E. sólida):
 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO

intercambiadores catiónicos intercambiadores aniónicos

carboximetilo (CM)
sulfopropilo (SP) dietilaminoetilo (DEAE)
fosforilo dietil-(2 hidroxipropil)aminoetilo
sulfonato polietilenimina
carboxilato

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
 También se llama de exclusión molecular.
 Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las
moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más
habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamaño.
 En este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño,
de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.
Aplicaciones:
 Para la purificación de una proteína (al igual que otras técnicas
cromatográficas).
 Se puede establecer una correlación entre el tamaño molecular y la
movilidad en la columna de exclusión, por lo que esta técnica se emplea
para determinar masas moleculares.
 Para eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra
proteica (p.ej. eliminación del exceso de reactivos tras tratar una proteína
en el laboratorio, eliminación de inhibidores enzimáticos,...). El resultado es
similar a una diálisis, pero más rápido.