ENSAYO DE

PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
Paola Pabón Peñaranda
Darcy Pinzón Sierra
Carolina Serrano Ferreira
TÓPICOS : Aislamiento de proteínas integrales de membrana, complejos
multiproteicos y el replegamiento de proteínas de cuerpos de inclusión. El
objetivo es presentar herramientas, estrategias y soluciones disponibles para
enfrentar los desafíos de purificación asociados con estas tres clases de proteínas
 PROTEINAS INTEGRALES DE
MEMBRANA

Funciones biológicas : transporte, señalización,

mantenimiento de estructuras celulares

Técnicas de purificación,handling, and analyzing con

el fin de optimizar su solubilidad en medio acuoso

Centrado en purificación de proteínas de membrana

bacteriana
PURIFICACIÓN DE PROTEINAS INTEGRALES DE MEMBRANA

-Elección de
-Uso de vectores
hospederos para la
Depende de la (10-50) -
expresión de la
concentración de la Proteína de importancia
proteína
proteína a etiquetada con
-Sobreexpresión
analizar(Alta o Baja) Polihistidina o GST
- USO DE BACTERIOFAGOS -Host E. coli BL21
(DE3) , vector pET
 EXPRESIÓN A PEQUEÑA ESCALA DE PROTEINAS MARCADAS CON HISTIDINA
DE Escherichia coli
1-Recoger las
células del cultivo
mediante
centrifugación de
7000 A 1000 X gr
durante 10-30
3) Buffer para lisis: minutos
20mM fosfato de sodio,
100mM cloruro de sodio,
20nM de imidazol,
0,5mM TCEP, 5 u/ml benzona, Dejar durante 2 h
con agitación suave
2-Deseche el
sobrenadante.
1mg/ml de losizima, a temperatura Coloque el
ambiente o 4 °C. sedimento
Cóctel de inhibidores de la proteasa sin EDTA ,
Ajustar pH bacteriano en hielo
1-2% de una selección de detergentes, pH 7.4
Agregar
IMIDAZOLe
3.Suspenda el
sedimento
bacteriano
agregando de 5 a 10
ml de tampón de
lisis por cada gramo
de células húmedas
COSECHA DE CÉLULAS

. Centrifugar a
6000 a 9000 × g a Centrifugar a 6000
4 ° C durante 15 a 9000 × g a 4 ° C El sedimento
minutos para durante 15 min celular re
recoger las suspender el suspendido se
células. sedimento celular puede almacenar a
en 10 ml de PBS –80 ° C

• Buffer: solución salina tamponada

• fosfatofosfato: 10 mM,
• KCl 2,7 mM, -
• NaCl 137 mM,
• pH: 7.4
 Alteración celular y preparación de membranas.

La ruptura celular produce una suspensión de fragmentos de

membrana / vesículas que contiene las proteínas de la membrana
se utiliza en combinación
con otras técnicas, por
ejemplo, choque por +Suave
congelación o choque + Produce grandes
LISIS ENZIMÁTICA osmótico; La lisozima se fragmentos de membrana
usa comúnmente para - Lento
romper las paredes
celulares de las bacterias
 PREPARACIÓN DE LA MEMBRANA
Membrana después de la disrupción
Membrana que se encontraba en congelación
 SOLUBILIZACIÓN
 permita la formación de un complejo estable de
proteínas, lípidos y detergentes y que no
elimine los lípidos nativos requeridos asociados
con la proteína objetivo

 el protocolo de solubilización permita la

formación de un complejo estable de proteínas,
lípidos y detergentes y que no elimine los
lípidos nativos requeridos asociados con la
proteína objetivo

 La actividad de retención requiere que estos

lípidos todavía estén presentes después de la
solubilización y la purificación

 la actividad de la proteína, que es la mejor

indicación de la estructura (y función) de la
Una banda fuerte en la posición esperada para la
proteína intacta
proteína diana indica alta expresión y / o
solubilización eficiente
 SELECCIÓN DE DETERGENTES
• detergentes actúan desintegrando la bicapa lipídica
al tiempo que incorporan lípidos y proteínas en las
micelas del detergente.

• extrae la proteína de membrana con un alto

rendimiento y da como resultado complejo estables
de proteína-detergente (o complejos de proteína-
lípido-detergente) donde la proteína retiene su
conformación activa
• las moléculas de detergente se asocian para formar
complejos multimoleculares, micelas, con interiores
hidrófobos y superficies hidrófilas
 ensayos para la actividad de
la proteína de membrana.
Preparación de la Centrifugar a 100 000 × g a
Pureza y homogeneidad
membrana 4°C por 45 min
ensayos específicos de
etiqueta de afinidad
Purificación de proteínas de membrana marcadas con histidina

Las proteínas marcadas con histidina

tienen afinidad por el Ni2 + y varios
otros iones metálicos que pueden
inmovilizarse en medios
cromatográficos utilizando ligandos
quelantes

una proteína que contiene una

etiqueta de histidina se unirá
selectivamente a medios cargados
de iones metálicos

forma rutinaria para la

sobreexpresión de proteínas de
membrana. Además, se ha sugerido
que la presencia de un conector, Las fracciones de (A) IMAC se purificaron adicionalmente mediante (B) filtración en gel.
(C) El análisis de SDS-PAGE de las fracciones seleccionadas muestra la pureza de la proteína
como la proteína fluorescente verde objetivo. La fracción D de la columna HisTrap HP fue esencialmente homogénea. M =
(GFP), entre la etiqueta de histidina marcador de peso molecular. El pico E probablemente contenía agregados de lípidos y
detergentes que dispersan la luz
y la proteína de membrana objetivo,
mejora la unión a los medios IMAC
PURIFICACIÓN
PURIFICACIÓN DE COMPLEJOS MULTIPROTÉICO

Identificar sus constituyentes y para la caracterización estructural y funcional.

- Interacción proteína-proteína

Complejos cerca de 10 hasta 100 subunidades

Retos : Estabilidad; Falsos positivos; Dinámica (interacciones transitorias);

Tamaño( muy largos – técnicas de filtración);Producción (sobre-expresión )
STEPS PURIFICACIÓN DE COMPLEJOS MULTIPROTÉICOS
Ensayo de extracción ( Pull down assay)

ENSAYO DE PURIFICACIÓN CO-

EXTRACCIÓN POR AFINIDAD INMUNOPRECIPIT
POR AFINIDAD TANDEM (TAP) ACIÓN
EXTRACCIÓN POR AFINIDAD
 EXTRACCIÓN POR AFINIDAD

8. Aplicar 600𝜇𝐿 del buffer PBS en cada

1. Suspender Glutathione Sepharose 4B en columna y repita centrifugación(LAVADOS
cada columna SpinTrap mediante agitación ADICIONALES)
con vórtex 9. Agregar 200𝜇𝐿 de buffer de elución 10mM
2. Coloque cada columna en un tubo limpio en glutanione, 50 mMTris-HCL pH 8 remplace las
microcentrifuga de 1,5 o 2mL . Centrifugar a tapas .reposo 5 min
735x g durante 1min 10 . Centrifugación en microcentrifuga
3. Deseche la solución tampón después de la 11. Recoger eluatos y analizar en SDS PAGE
centrifugación
4. Adicione a una columna 600𝜇𝐿 de
lisado celular con GST-BAIT y en otra
columna el mismo volumen de lisado sin
la proteína cebo dejar en reposo 2hr
5. Cada columna en microcentrifuga 1,5
o 2 ml x 735g x 1min
6. Obtener flujo para análisis en SDS –
PAGE
7. Repetir paso 5
PURIFICACIÓN AFINIDAD TANDEM (TAP)
PURIFICACIÓN AFINIDAD TANDEM (TAP)