Medios de Cultivo y Pruebas Bioquimica

Medios de Cultivo
y
Pruebas
Bioquímicas
Medios
de
Cultivo
INTRODUCCIÓN
Uno de los sistemas más importantes para

la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y
el crecimiento de los microorganismos es
el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad
y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.
Medios de Cultivo
Clasificación de los medios de cultivo basándose en su
composición química
A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,

fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros
elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella
abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.
B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan

ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,
extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber
con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente)
aditivos adicionales para favorecer el crecimiento con de determinados
microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).
Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento
específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población
microbiana mixta.
Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando

cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como
única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades
diferenciales de crecimiento en dichos medios.
Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey

diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte
rápida de las células.
Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos,

acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento.
Agar-Agar
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos
nutritivos.
Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de

alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de
agua destilada. Mezclar y dejar reposar
Extracto de carne 3.0
5 minutos. Calentar suavemente
Cloruro de sodio 8.0 agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su
disolución. Distribuir y esterilizar a 121 C
Agar 15.0 durante 15 minutos.
pH final: 7.3 0.2

Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de

microorganismos exigente en sus
requerimientos nutricionales.
poco s No contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano.
La pluripeptona es la fuente de carbono y

nitrógeno para el desarrollo bacteriano.
El agregado de cloruro de sodio permite el

enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de
microorganismos exigentes.
Características del medio: ámbar

claro a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris
Base Agar Gelosa Sangre
Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos

microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el
aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios
nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como
para la observación de reacciones de hemólisis.
También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.
Fórmula (en gramos por litro)

Infusión de músculo de corazón 375.0
Peptona 10.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3
0.2
Fundamento
La infusión de músculo de corazón y la

peptona, otorgan al medio un alto valor
nutritivo, que permite el crecimiento de
una gran variedad de microorganismos,
aún de aquellos nutricionalmente
exigentes.
El cloruro de sodio mantiene el balance

osmótico.
El agregado de sangre al medio de

cultivo, en concentración final de 5-10
%, aporta nutrientes para el crecimiento
bacteriano, y permite Características del medio
detectar hemólisis. Medio preparado: ámbar.
Medio preparado con 5% de sangre

de carnero: rojo cereza.
E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Peptona 10.0
Suspender 36 g del polvo en un litro
Lactosa 5.0 de agua destilada. Reposar 5
Sacarosa 5.0 minutos; mezclar, calentando a
ebullición durante 1 o 2 minutos
Fosfato dipotásico 2.0 hasta su disolución. Esterilizar en
Agar 13.5 autoclave a no más de 121 C durante
15 minutos. Enfriar a 45 C y distribuir
Eosina 0.4 agitando suavemente.
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 0.2
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras
especies de bacilos Gram negativos.
La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y

aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul
de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico

brillo metálico.
Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o
rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes
Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

transparentes,
La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

C. albicans
Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las
cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello
se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de

Salmonella y Shigella.
Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Verdosas con brillo metálico y centro
Escherichia coli negro azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras
Características del
medio
Mac Conkey Agar
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias
que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0
Suspender 50 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0
agua destilada. Reposar 5 minutos y
Mezcla de sales biliares 1.5 mezclar hasta uniformar. Calentar
suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en
Agar 13.5 autoclave a 121 C durante 15
minutos.
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el

desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa,
disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en
las colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Resultados
Microorganismos Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes
Shigella flexneri Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas
Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura
Estafilococo 110 Agar
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de

estafilococos, en base a la producciónde pigmentos, la fermentación de
manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.

Extracto de levadura 2.5
Tripteína 10.0 Suspender 149 g del medio en un
litro de agua destilada. Reposar 5
Gelatina 30.0
minutos y mezclar calentando a
Lactosa 2.0 ebullición durante 1 o 2 minutos.
Esterilizar en autoclave durante 15
D-Manitol 10.0 minutos a 121 C. Verter en placas y
Cloruro de sodio 75.0 mezclar para dispersar el
precipitado.
Fosfato dipotásico 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.0 0.2
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación

alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos
selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio 110.
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los

nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de
la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono
fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para
inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp.,
lográndose así un medio selectivoparael desarrollo de estos
microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es
que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación presuntiva
de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e
hidrólisis de la gelatina.
Resultados
Observar las características colonias y realizar las pruebas de

de las identificación de
microorganismos.
1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol
a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de
la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado
entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de

crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos
permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento

bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de
amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis
durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Resultados Fermentación de Hidrólisis Prueba de

Microorganismo Pigmento
manitol de la la
gelatina coagulasa
S. aureus + + + +
S. aureus + + + +
S. epidermidis - - + -

Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Sal y Manitol Agar
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

diferenciación de estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir

de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales
de importancia sanitaria.
También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas

de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio
Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por litro
de agua destilada. Reposar 5
d-Manitol 10.0 minutos y mezclar calentando a
ebullición durante 1 o 2 minutos.
Distribuir y esterilizar en autoclave a
Agar 15.0 118-121 C durante 15 minutos.
Rojo de fenol 0.025
pH final: 7.4 0.2
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;

las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona

roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de
cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de
carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración)
es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo
fenol es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y
fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio
y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no

fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan

como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias

rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.
Resultados
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla
Staphylococcus epidermidis ATCC
Bueno Roja
14990
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

Medio preparado: rojo
Salmonella Shigella Agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas

especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

Pluripeptona 5.0
Suspender 60 g del polvo por litro
Lactosa 10.0 de agua destilada. Reposar 5
Mezcla de sales biliares 8.5 minutos y mezclar hasta
homogeneizar.
Citrato de sodio 8.5 Calentar a ebullición durante 2 o
Tiosulfato de sodio 8.5 3 minutos. NO ESTERILIZAR
EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50
Citrato férrico 1.0 C y distribuir unos 20 ml por
Agar 13.5 placa.
Secar la superficie del medio
Verde brillante 0.00033 unos minutos en la estufa.
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 0.2
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la

sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido

sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,

acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias
rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,

crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La
producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro
debido a la formación de sulfuro de hierro.
Resultados
Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis Transparentes, centro negro
Escherichia coli Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy
Enterococcus faecalis escaso
crecimiento

Medio preparado: rojo naranja.
A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac B. Escherichia coli .Acid + Lac
+ C: Salmonella sp..H2S + D: Proteus mirabilis H2S
E: Pseudomona aeruginosa
Mueller Hinton
Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de
sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangre
para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio
deshidratado en un litro de agua
Peptona ácida de caseína 17.5
destilada. Dejar embeber de 10 a 15
Almidón 1.5 minutos. Calentar con agitación
frecuente y hervir durante 1 minuto.
Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Enfriar a 45 -50 C y distribuir a cajas de
Petri (o agregar los suplementos que
Agar 15.0
se desee) hasta un nivel de 4 mm
sobre una superficie horizontal (25-30
ml en placas de 9 cm de diámetro).
pH final: 7.3 0.1

Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en

forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a
una serie de factores :
• presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,
• su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es

bajo,
• la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Resultados
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la

metodología apropiada.
Medio preparado: ámbar.
Chromobacterium violaceum Pseudomona aeruginosa Streptococcus

pyogenes
Cerebro Corazón Infusión
Medio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias

aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,
neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utiliza

este medio para el cultivo de hongos patógenos.

Infusión de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro
Infusión corazón vacuno 250.0 de agua destilada. Calentar a
ebullición hasta disolver
Peptona 10.0 completamente.
Cloruro de sodio 5.0 Esterilizar en autoclave a 121 C
Glucosa 2.0 durante
15 minutos. Los tubos que no se usen
Fosfato disódico 2.5 inmediatamente deberán calentarse
en un baño hirviendo para la
eliminación del oxígeno retenido.
Enfriar rápidamente sin agitar.
pH final: 7.4 0.2

Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo

microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y
la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene

el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer.
Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya que
en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos excepto los
tiol y piridoxal dependientes.
Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reacciones
en la prueba de la coagulasa.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe la

flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos
patógenos.
Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea
necesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificación
bioquímica.
Microorganismos Crecimiento
Neisseria meningitidis Bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae Bueno a excelente
Streptococcus pyogenes Bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae Bueno a excelente

Medio preparado: ámbar claro, sin precipitado.
왼왼 : uninoculated tube
왼왼 : Neisseria meningitidis
왼왼왼 : Strepcococcus
pyogenes
Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella

spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.

Peptona 5.0
Suspender 46 g del polvo en 1 litro de
Sales biliares 1.0 agua destilada. Mezclar vigorosamente y
Carbonato de calcio 10.0 llevar a ebullición. Enfriar a 45 C o
menos. Agregar 20 ml de solución
Tiosulfato de sodio 30.0 iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por
pH final: 8.4 tubo, en tubos estériles. No debe
0.2 calentarse luego de agregar la solución
iodada. El medio base puede
Solución iodo iodurada
mantenerse a 4 C , dura varios meses,
Iodo 6.0 pero una vez agregada la solución
Ioduro de potasio 5.0 iodada debe usarse en el mismo día.
Agua 20.0
Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe
metabolitos tóxicos.
La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato

(generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales
biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la
flora acompañante.
Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar

40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada
Resultados
Microorganismos Crecimiento
Salmonella typhi Escaso
Salmonella typhimurium Bueno-excelente
Salmonella enteritidis Bueno-excelente
Escherichia coli Escaso

Medio preparado: suspensión blanco lechosa.
Stuart Medio de Transporte
Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestras

clínicas aptaspara exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la
viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difícil desarrollo.

Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro
Glicerofosfato de sodio 10.0 de agua destilada. Reposar 5
minutos.
Cloruro de calcio 0.1
Calentar a ebullición hasta
Azul de metileno 0.002 disolución total. Distribuir en tubos
con cierre a rosca (para evitar
Agar 3.0 oxidación) llenándolos hasta 2/3 del
tubo.
Esterilizar 15 minutos a 121ºC.
Dejar solidificar en posición
vertical.
pH final: 7.4 0.2
Fundamento
Medio semisólido, no nutritivo.
Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil

para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de metileno,
que es el indicador de oxido reducción.
De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su

envío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados con
carbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenos
entéricos y respiratorios.
Resultados
Los tubos con medio de transporte

se subcultivan en medios sólidos
apropiados según la muestra y el
microorganismo que se quiera
aislar. Luego de la incubación, debe
haber escasa o nula reducción de la
viabilidad de los microorganismos.
medio
opalescente
Medio con
preparado: ligeramente
tonalidad
dependiendo azul grado
del oxidación. de
Pruebas
Bioquímica
s
INTRODUCCIÓN
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de

manera detallada su actividad bioquímica, porque otras características
no
son suficientemente distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de técnicas para
numerosas caracterización bioquímica de una la
especie.
Además de los productos finales de los procesos metabólicos, también se
necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como
ocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimas intervienen,
cuales son los productos intermediarios además de que se deben
reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas que tienen lugar
dentro de la célula.
En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una

sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del
cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.
Enterotube
II
Kligler Hierro Agar
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos

para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de
glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.

Peptona de carne 13.0
Suspender 54.8 g del polvo por litro de
Lactosa 10.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar
Tripteina 10.0 con agitación frecuente, hervir 1 o 2
minutos hasta disolución total. Llenar
Glucosa 1.0 hasta la tercera parte de los tubos de
Citrato de hierro y amonio 0.5 ensayo. Esterilizar a 121 C por 15
minutos. Enfriar en pico de flauta
Tiosulfato de sodio 0.3 profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
•En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los

nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.
•La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
•El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de

ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe
3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro
de hierro, de color negro.
•El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el

balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
•
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio ácido.
•El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo el microorganismo
amarillo): solamente fermenta la glucosa.
2Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el

microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
3Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no

fermentador de azúcares.
4La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el

microorganismo produce gas.
5El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido

sulfhídrico.
medio

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciación

de enterobacterias, en base a la fermentación de
glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido
sulfhídrico.
Pluripeptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro
de agua destilada. Mezclar bien y
Lactosa 10.0 calentar con agitación frecuente,
Sacarosa 10.0 hervir 1 o 2 minutos hasta
disolución total. Llenar hasta la
Glucosa 1.0 tercera parte de los tubos de
Sulfato de hierro y amonio 0.2 ensayo. Esterilizar a
121 C por 15 minutos. Enfriar en
Tiosulfato de sodio 0.2 pico
Rojo de fenol 0.025 de flauta profundo.
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la

pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano.
La lactosa,sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono

fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de
ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+
, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene

el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan

por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en
medio ácido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro
de hierro de color negro.
Resultados
Lisina Hierro Agar
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente

Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en
la producción de ácido sulfhídrico.

Peptona de gelatina 5.0
Suspender 35 g del medio
Extracto de levadura 3.0 deshidratado en un litro de agua
destilada. Dejar embeber unos 15
Glucosa 1.0
minutos. Calentar cuidadosamente,
Lisina 10.0 agitando con frecuencia y hervir
durante un minuto hasta la
Citrato de hierro y amonio 0.5
disolución completa. Distribuir y
Tiosulfato de sodio 0.04 esterilizar a
Púrpura de bromocresol 0.02 121 C durante 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta dejando un fondo
Agar 15.0 vertical apto para la punción.
pH final: 6.7 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura

aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la

producción de ácido sulfhídrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a

pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza

el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido,

por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del

medio debido a la formación de sulfuro de hierro.
Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,

desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la
sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la
superficie del medio.
Resultados
1 Decarboxilación de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2 Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas género
Proteus, Providencia y del cepas de spp.
alguna Morganella
3-Producción de ácido sulfhídrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el
límite del pico y fondo)

Medio preparado: color violeta.
Microorganismos Color en el pico de flauta Color en la base del tubo Ennegrecimiento
del medio
Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo
Salmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo
Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo
Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Púrpura Púrpura Negativo
Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo
MIO Medio
Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,

actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.

Dextrosa 1.0
Extracto de levadura 3.0
Suspender 31 g del polvo en
Peptona 10.0 un litro de agua destilada.
Tripteína 10.0 Calentar a ebullición hasta
completa disolución. Distribuir
Clorhidrato de L-ornitina 5.0 en tubos y esterilizar 15
Agar 2.0 minutos a 121 C.
Púrpura de bromocresol 0.02

pH final: 6.5 0.2
Fundamento
Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de

extracto de levadura, peptona y tripteína.
Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la

enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato

para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y
en medio ácido es amarillo.
Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:

movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento
que difunde mas allá de la línea de inoculación.
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.
Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol
vire al amarillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la

enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.
Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del

indicador hacia el color púrpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que

contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de
agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado
positivo.
Resultados
1 Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la

línea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
2 Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color púrpura.

-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color
violáceo en la superficie del medio.
3 Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y

la prueba de ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-
amarillento.

Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.
SIM Medio
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol

y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros
de la familia Enterobacteriaceae.

Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua
Peptona 6.1 destilada. Mezclar hasta disolver; calentar
agitando y hervir durante un minuto.
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y
Tiosulfato de sodio 0.2 esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
minutos.
Agar 3.5
Solidificar en posición vertical.
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y

particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.
El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de

Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado
negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas

allá de la línea de siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea

de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la

línea de siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el

reactivo de Kovac s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Medio preparado: ámbar.
Urea
Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la

actividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp.
de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Urea 20.0
Suspender 3, 87 g del medio
Fosfato monopotásico 9.1 deshidratado por cada 100 ml de
agua destilada. Disolver sin
Fosfato disódico 9.5 calentar y esterilizar por filtración.
Distribuir en tubos pequeños
Extracto de levadura 0.1 estériles, entre 0,5 y 2 ml.
Rojo fenol 0.01
pH final: 6.8 ± 0.2

Fundamento
Este medio de cultivo, formulado por y Stuart, presenta bajo

Rustigian contenido de nutrientes y alta capacidad
buffer.
El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y

cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el
indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno

proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido de
carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar el
indicadorrojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para
diferenciar Proteus spp. de otros géneros.
Medio preparado: anaranjado.
Urea-
1 Uninoculated Control,
2 Proteus Vulgaris,
3 E. coli
Simmons Citrato Agar
Medio para la enterobacterias, en base a

utilizado diferenciación de usar fuente la y
carbono
capacidad de citrato como única de energía.

Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de agua
Fosfato dipotásico 1.0 destilada. Dejar reposar 5 minutos y
Fosfato monoamónico 1.0 mezclar calentando a ebullición
durante 1 o 2 minutos. Distribuir en
Sulfato de magnesio 0.2 tubos y esterilizar en autoclave a 121
Azul de bromotimol 0.08 C durante 15 minutos. Enfriar en
posición inclinada.
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el

citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el
indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de

utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única
fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento
del citratoda progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este
último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos
que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatosy bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul
y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no
hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo Citrato permeasa Color del medio
Klebsiella pn eumoniae Positivo Azu l
S. typh imu rium Positivo Azu l
E. coli Negativo Verde
S. flexn eri Negativo Verde

Medio preparado: verde.
Gracias!

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Medios de Cultivo

Uno de los sistemas más importantes para

El material alimenticio en el que crecen los

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan

Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento

Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos,

Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

pH final: 7.3 0.2

Es un medio usado para el cultivo de

La pluripeptona es la fuente de carbono y

El agregado de cloruro de sodio permite el

Características del medio: ámbar

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos

Fórmula (en gramos por litro)

La infusión de músculo de corazón y la

El cloruro de sodio mantiene el balance

El agregado de sangre al medio de

Medio preparado con 5% de sangre

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación

En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los

Observar las características colonias y realizar las pruebas de

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Resultados Fermentación de Hidrólisis Prueba de

Características del medio

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.

Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;

Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias

Características del medio

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la

Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,

Características del medio