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Fluorescenza in stato
stazionario
Condizioni fotostazionarie
d M 
 k M   (k  k )M   0
*
k k M+hn’ r *
A A r nr
M+hn M* dt
k M   (k  k )M 
k M nr *
A st r nr st

M   k  k  *
st A
M st (k r  k nr )
A

 
I st  k r M * st  k r k A M st  cost.
I st  k r  

•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di
fluorofori.
•L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica.
•Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal
flusso di fotoni)
Il fluorimetro
Lampada Beam splitter
Campione
lecc.

lem.
Lente
Monocromatore
di eccitazione Lente

Monocromatore
Computer di emissione

PMT PMT
“riferimento” “segnale”
I
Strumentazione
Fluorescenza in stato
stazionario
Sorgente
Lampada ad arco
ad alta pressione di xeno
• L’elevata tensione applicata agli
elettrodi provoca una corrente.
• Il flusso di elettroni, urtando gli
atomi del gas, li ionizza o li
eccita.
• Il decadimento o la
ricombinazione ione-elettrone
generano l’emissione di luce.
Lampada Xe (ozone-free)
• Ad alta pressione (20-300 Atm). Può esplodere (non 0.1
implodere).
• Gli impulsi ad alta tensione (40000 V) necessari per accenderla
possono danneggiare l’elettronica. Va accesa per prima.
• La lampada è in quarzo, per permettere il passaggio degli UV. 0.01

Intensità (u.a.)
Questa radiazione però ionizza le molecole di ossigeno
dell’aria, che a loro volta generano ozono (che va rimosso per
non danneggiare l’ottica). Se la radiazione nel lontano UV non è
0.001
necessaria, si aggiunge all’involucro uno strato in grado di 467nm
bloccare questa radiazione (lampade ozone-free, molto comuni
nei fluorimetri).
• Il picco a 467 nm viene comunemente utilizzato per calibrare il 0.0001
monocromatore di eccitazione. 200 300 400 500 600 700 800

l(nm)
Rivelatore
Rivelatore della fluorescenza
effetto fotoelettrico
Rivelatore della fluorescenza
tubo fotomoltiplicatore (PMT)

•Effetto fotoelettrico
•Emissione secondaria
•I fotocatodi sono realizzati utilizzando metalli alcalini o semiconduttori.
•L’efficienza fotoelettrica non è costante con l.
Il PMT può rivelare un singolo fotone (106 e- per fotone)

Rivelazione analogica

Rivelazione digitale
Rivelazione analogica

Rivelazione digitale
Rivelazione digitale: maggiore sensibilità, intervallo dinamico più ristretto.
Rivelazione digitale
Sovrapposizione di impulsi

Durata impulsi 10-9-10-8 s


Limite superiore 105-106 cps

S n
  n
Per n=10000, S/N=100
Limite inferiore 103-104 conteggi
N n
Si può aumentare la sensibilità semplicemente aumentando
il tempo di integrazione
Distribuzione di Poisson
• Consideriamo un fotomoltiplicatore esposto ad una sorgente di
intensità costante.
• L’emissione (e la rivelazione) sono processi casuali.
• Qual’è la distribuzione di probabilità dei fotoni rivelati in t secondi?
• Definiamo Pn(t) come la probabilità che in un tempo t vengano
rivelati n fotoni. È questa la distribuzione che cerchiamo.
• Definiamo k in base alla seguente equazione (sviluppo in serie):
P1(dt)=kdt+o(kdt)kdt
• Avremo P0(dt)=1-kdt
• Calcoliamo ora la probabilità di non rivelare fotoni in un intervallo in
un intervallo finito t.
Distribuzione di Poisson
Per rivelare 0 fotoni in un tempo t, deve averne rivelati 0 nel tempo t-dt e 0 nel tempo dt

P0 (t )  P0 (t  dt ) P0 (dt )  P0 (t  dt )1  kdt   P0 (t  dt )  P0 (t  dt )kdt


P0 (t )  P0 (t  dt )   P0 (t  dt )kdt
P0 (t )  P0 (t  dt )
 kP0 (t  dt )
dt
P (t )  P0 (t  dt )
lim 0  lim  kP0 (t  dt )
dt  0 dt dt  0

dP0 (t )
 kP0 (t )
dt
dP0 (t )
 kdt
P0 (t )
LnP0 (t )  LnP0 (0)  kt
LnP0 (t )  Ln1  kt
LnP0 (t )  kt
P0 (t )  e  kt
Distribuzione di Poisson
Troviamo ora un’equazione analoga per Pn(t)
Pn (t )  Pn (t  dt ) P0 (dt )  Pn 1 (t  dt ) P1 (dt )
 Pn (t  dt )(1  kdt )  Pn 1 (t  dt )kdt
 Pn (t  dt )  Pn (t  dt )kdt  Pn 1 (t  dt )kdt

Pn (t )  Pn (t  dt )   Pn (t  dt )kdt  Pn 1 (t  dt )kdt
Pn (t )  Pn (t  dt )
  k Pn (t  dt )  Pn 1 (t  dt )
dt

Pn (t )  Pn (t  dt )
lim  lim  k Pn (t  dt )  Pn 1 (t  dt )
dt  0 dt dt  0

  k Pn (t )  Pn 1 (t )
dPn (t )
dt

Quest’equazione differenziale lega Pn a Pn-1. Grazie ad essa ed al


dPn (t )
 kPn (t )  kPn 1 (t ) fatto che conosciamo P0, possiamo trovare la funzione di
dt distribuzione.
Distribuzione di Poisson
Integriamo l’equazione differenziale, moltiplicando per ekt
dPn (t ) P2 (t ) 
 kPn (t )  kPn 1 (t ) P1 (t ) 
dt t t

 P1 (t ' )dt ' 


 kt
 ke kt  e kt ' P0 (t ' )dt '   ke
dP (t ) kt '
e kt n  kekt Pn (t )  kekt Pn 1 (t ) e
dt 0 0
t
de kt Pn (t ) t
 kekt Pn 1 (t )  ke kt  e kt 'e  kt 'dt '   ke kt  e kt 'kt ' e  kt 'dt ' 
dt 0
0
t
e kt Pn (t )  Pn (0)   kekt' Pn 1 (t ' )dt '
t t

 t ' dt ' 
2  kt
 ke kt  dt '  k e
0
0 0
t
e Pn (t )   ke Pn 1 (t ' )dt '  kte kt
2 2
kt kt ' t ( kt )
 k 2 e  kt  e  kt
0 2 2
t

 Pn 1 (t ' )dt '


 kt
Pn (t )  ke e kt '

n
0
(kt )  kt
Pn (t )  e
n!
Distribuzione di Poisson
Calcoliamo la media
j 
n  n 
(kt ) n  kt n 
(kt ) n 1 (kt ) j
n(t )   nPn (t )   n e  e kt 
 kt
kte 
 kt
 kte kte kt  kt
n 0 n 1 n! n 1 ( n  1)! j  0 ( j )!

k rappresenta il rate (medio) di rivelazione di fotoni!

Calcoliamo la deviazione standard


 n2  n 2  n
2

n 2  n 2  n  n  n 2  n  n  n(n  1)  n

 n2  n(n  1)  n  n  n(n  1)  kt  (kt ) 2


2

n  n 
(kt ) n  kt
n(n  1)   n(n  1) Pn (t )   n(n  1) e 
n 0 n2 n!
j 
(kt ) n  2
n 
(kt ) j
e  kt
(kt ) 
2
(kt ) e 
2  kt
 (kt ) 2 e  kte kt  (kt ) 2
n  2 ( n  2)! j  0 ( j )!

 n2  n(n  1)  kt  (kt ) 2  (kt ) 2  kt  (kt ) 2  kt  n


Media e deviazione standard sono uguali!
Se n è il numero medio di
conteggi al secondo:
S n
  n
N n

Il rapporto segnale-rumore
aumenta con la radice di n