Fluorescenza in stato stazionario Condizioni fotostazionarie d M k M (k k )M 0 * k k M+hn’ r * A A r nr M+hn M* dt k M (k k )M k M nr * A st r nr st
M k k * st A M st (k r k nr ) A
I st k r M * st k r k A M st cost. I st k r
•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di fluorofori. •L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica. •Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal flusso di fotoni) Il fluorimetro Lampada Beam splitter Campione lecc.
lem. Lente Monocromatore di eccitazione Lente
Monocromatore Computer di emissione
PMT PMT “riferimento” “segnale” I Strumentazione Fluorescenza in stato stazionario Sorgente Lampada ad arco ad alta pressione di xeno • L’elevata tensione applicata agli elettrodi provoca una corrente. • Il flusso di elettroni, urtando gli atomi del gas, li ionizza o li eccita. • Il decadimento o la ricombinazione ione-elettrone generano l’emissione di luce. Lampada Xe (ozone-free) • Ad alta pressione (20-300 Atm). Può esplodere (non 0.1 implodere). • Gli impulsi ad alta tensione (40000 V) necessari per accenderla possono danneggiare l’elettronica. Va accesa per prima. • La lampada è in quarzo, per permettere il passaggio degli UV. 0.01
Intensità (u.a.) Questa radiazione però ionizza le molecole di ossigeno dell’aria, che a loro volta generano ozono (che va rimosso per non danneggiare l’ottica). Se la radiazione nel lontano UV non è 0.001 necessaria, si aggiunge all’involucro uno strato in grado di 467nm bloccare questa radiazione (lampade ozone-free, molto comuni nei fluorimetri). • Il picco a 467 nm viene comunemente utilizzato per calibrare il 0.0001 monocromatore di eccitazione. 200 300 400 500 600 700 800
l(nm) Rivelatore Rivelatore della fluorescenza effetto fotoelettrico Rivelatore della fluorescenza tubo fotomoltiplicatore (PMT)
•Effetto fotoelettrico •Emissione secondaria •I fotocatodi sono realizzati utilizzando metalli alcalini o semiconduttori. •L’efficienza fotoelettrica non è costante con l. Il PMT può rivelare un singolo fotone (106 e- per fotone)
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale Rivelazione analogica
Rivelazione digitale Rivelazione digitale: maggiore sensibilità, intervallo dinamico più ristretto. Rivelazione digitale Sovrapposizione di impulsi
Durata impulsi 10-9-10-8 s
Limite superiore 105-106 cps
S n n Per n=10000, S/N=100 Limite inferiore 103-104 conteggi N n Si può aumentare la sensibilità semplicemente aumentando il tempo di integrazione Distribuzione di Poisson • Consideriamo un fotomoltiplicatore esposto ad una sorgente di intensità costante. • L’emissione (e la rivelazione) sono processi casuali. • Qual’è la distribuzione di probabilità dei fotoni rivelati in t secondi? • Definiamo Pn(t) come la probabilità che in un tempo t vengano rivelati n fotoni. È questa la distribuzione che cerchiamo. • Definiamo k in base alla seguente equazione (sviluppo in serie): P1(dt)=kdt+o(kdt)kdt • Avremo P0(dt)=1-kdt • Calcoliamo ora la probabilità di non rivelare fotoni in un intervallo in un intervallo finito t. Distribuzione di Poisson Per rivelare 0 fotoni in un tempo t, deve averne rivelati 0 nel tempo t-dt e 0 nel tempo dt
Quest’equazione differenziale lega Pn a Pn-1. Grazie ad essa ed al
dPn (t ) kPn (t ) kPn 1 (t ) fatto che conosciamo P0, possiamo trovare la funzione di dt distribuzione. Distribuzione di Poisson Integriamo l’equazione differenziale, moltiplicando per ekt dPn (t ) P2 (t ) kPn (t ) kPn 1 (t ) P1 (t ) dt t t
P1 (t ' )dt '
kt ke kt e kt ' P0 (t ' )dt ' ke dP (t ) kt ' e kt n kekt Pn (t ) kekt Pn 1 (t ) e dt 0 0 t de kt Pn (t ) t kekt Pn 1 (t ) ke kt e kt 'e kt 'dt ' ke kt e kt 'kt ' e kt 'dt ' dt 0 0 t e kt Pn (t ) Pn (0) kekt' Pn 1 (t ' )dt ' t t
t ' dt ' 2 kt ke kt dt ' k e 0 0 0 t e Pn (t ) ke Pn 1 (t ' )dt ' kte kt 2 2 kt kt ' t ( kt ) k 2 e kt e kt 0 2 2 t
Pn 1 (t ' )dt '
kt Pn (t ) ke e kt '
n 0 (kt ) kt Pn (t ) e n! Distribuzione di Poisson Calcoliamo la media j n n (kt ) n kt n (kt ) n 1 (kt ) j n(t ) nPn (t ) n e e kt kt kte kt kte kte kt kt n 0 n 1 n! n 1 ( n 1)! j 0 ( j )!
k rappresenta il rate (medio) di rivelazione di fotoni!
Calcoliamo la deviazione standard
n2 n 2 n 2
n 2 n 2 n n n 2 n n n(n 1) n
n2 n(n 1) n n n(n 1) kt (kt ) 2
2
n n (kt ) n kt n(n 1) n(n 1) Pn (t ) n(n 1) e n 0 n2 n! j (kt ) n 2 n (kt ) j e kt (kt ) 2 (kt ) e 2 kt (kt ) 2 e kte kt (kt ) 2 n 2 ( n 2)! j 0 ( j )!
