Ciências Biomédicas Laboratoriais ∙ 3º Ano ∙ 2018/2019

Em Direção a Enzimas Eficientes na

Geração de Sangue Universal através
da Evolução Dirigida à Estrutura
Componente Teórica ∙ Imunohematologia

Prof.ª Maria Manuela Amorim ∙ Prof.ª Sandra Marlene Mota

Helder Pereira // 10160531
Natacha Pinto // 10160425
Rui M. Soares // 10160467
Teresa Torres // 10160505
Verónica Rumor // 10160511
 Em Direção a Enzimas Eficientes na Geração de Sangue Universal através da Evolução Dirigida à Estrutura

• Objetivo
• Métodos

• Discussão
• Conclusão
• Resultados
SUMÁRIO

• Contextualização

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CONTEXTUALIZAÇÃO

Qual é o procedimento a adotar quando um paciente precisa de

uma transfusão de sangue mas não há dádivas compatíveis no
banco de sangue?

“CRIAR” SANGUE REMOVER OS ANTIGÉNIOS

COMPATÍVEL DOS ERITRÓCITOS

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CONTEXTUALIZAÇÃO
• As transfusões de sangue são importantes em muitos procedimentos
médicos e implica a fenotipagem dos eritrócitos;

• Os antigénios clinicamente mais importante são o A e o B do sistema

ABO  Ponto de partida

• Transformação dos Antigénios A e B em O (ou Antigen Null RBCs)

• Formação de Sangue compatível com todos os outros tipos deste sistema

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CONTEXTUALIZAÇÃO

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CONTEXTUALIZAÇÃO

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CONTEXTUALIZAÇÃO

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CONTEXTUALIZAÇÃO

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CONTEXTUALIZAÇÃO

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CONTEXTUALIZAÇÃO
• Enzima isolada de Clostridium
perfringens

• 1º Membro da Familia de
hidrólases GH (Glycosidade
Hydrolase) 98 - EABase

• Remoção do tri-sacarídeo do
antigénio A e B  Antigen Null
Site of cleavage of A- and B-antigens by GH98 EABase enzymes
from type 2 chains of erythrocytes.
RBCs

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CONTEXTUALIZAÇÃO
• EABase de Streptococcus
pneumoniae tem hidrólise
eficiente em cadeias tipo 2;

• Presença de antigénios do tipo 1,3

e 4 varia de pessoa para pessoa,
enquanto que a sua distribuição
varia com o tecido ou o tipo de
célula;

• Hidrólise lenta das Gal-1,3-

GalNAc (Cadeia tipo 1,3,4)
comparado com Gal-1,4-GalNAc
(cadeia tipo 2)

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OBJETIVO

Melhorar a atividade da EABase SP3

GH98 de Streptococcus pneumoniae SP3-
BS71 para ligações Gal-1,3 por
mutagénese dirigida à estrutura

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MÉTODOS
• Síntese de metilumbeliferil oligossacarídeos
• Metilumbeliferil tipo 1 do grupo sanguíneo A
• Metilumbeliferil β-galactosidio foi adicionado às linhas celulares SD161 de E. coli
que expressam 5 genes de origem em 3 bactérias (Clostridium perfringiens,
Helicobacter pylori e Campylobacter jejuni) e 1 de origem humana.
• Todos os genes foram expressos em 3 plasmídeos compatíveis sob o controlo do
promotor da lactose (Plac).
• As células E.coli SD161 cresceram num meio com uma densidade elevada e foi
adicionado metilumbeliferil β- galactosideo. Após 24h de incubação, as células
foram colhidas por centrifugação e o metilumbeliferil pentassacarídeo (MU-
Type1Apenta) foi extraído, por permeabilização das células através de um
aquecimento até à ebulição, durante 20 minutos, e de seguida purificadas por
eluição.
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MÉTODOS

• Síntese de metilumbeliferil oligossacarídeos

• Metilumbeliferil tipo 2 do grupo sanguíneo A
• O tetrassacarídeo MU-type2Atetra foi sintetizado enzimáticamente a partir do
metilumbeliferil β-N-acetil-D-glucosaminopiranosideo, α-D-galactosil fluorideo, GDP-
fucose e UDP-N-acetil-D-galactosamina usando glicosintase Abg-2F6 e a
glicosiltransferase WbgL e BgtA.

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MÉTODOS
• Construção do sistema de expressão EAbaseMetilumbeliferil tipo 1 do
grupo sanguíneo A
• O gene de interesse contêm a EAbase enzyme e a
proteína N-acetilhexosaminidase necessárias para a
reação de acopolamento, para coexpressão a partir
de um vetor de expressão apropriado na E.coli.
Foram amplificados diversos genes extraidos de
diversas bactérias por PCR, o qual se determinou que
o gene Sp3GH98 exibiu uma melhor atividade para o
substrato MU-Type1Apenta do que o gene CpGH98,
logo o gene Sp3GH98 foi utlizado como template
para a construção de uma biblioteca de genes.
• Realizou-se mutações dirigidas individualmente para
4 gerações diferentes dessa biblioteca genética.
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MÉTODOS
• Sreening das bibliotecas genéticas mutada
• Os genes mutados foram inseridos em E.coli e cultivados em meios com
canamicina e cloranfenicol . Das bactérias isoladas extraiu-se as enzimas em
estudo e adicionou-se o substrato MU-Type1Apenta.
• As reações foram monitorizadas por fluorescência.

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MÉTODOS
• Cinética enzimática
• Realizou-se um ensaio enzimático acoplado, o ensaio descontinuo foi
realizado a 30°C, usando 1µM da enzima variante Sp3GH98, e no ensaio de
lavagem (contém 50mM de fosfato de sódio e 100mM de cloreto de sódio) foi
utilizado ente 0 a 2.5mM de MU-Type1Apenta, incluindo 0.05mg/mL de
SpHex e β-galactosidase da E.coli.
• A medição foi feita por fluorescência e os resultados foram comparados a
valores de referência do composto 4-metilumbeliferona. O método foi
também realizado para Sp3GH98 wild-type e 5E.3-N06 mutantes usando o
substrato MU-type2Atetra, o qual contém a ligação Galβ-1,4-GlcNac ideal
para a enzima Sp3GH98.

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MÉTODOS
• Determinação do Tm de variantes Sp3GH98
Variante de Sp3GH98 tratado com
fosfato de sódio e cloreto de
sódio a um pH de 7.4.

Parte dos variantes, são tratados

adicionalmente com SYPRO orange
protein gel stain.

Aquecimento num termociclador,

num gradiente entre os 25 e 99°C,
com recolha dos dados da
fluorescência a cada minuto.

Determinação de Tm (termoestabilidade)
a partir das curvas de fluorescência.
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MÉTODOS
• Deteção da remoção antigênica por imunofluorescência
• Para o ensaio de imunofluorescência, as células A foram tratadas com a
enzima Sp3GH98 variante, e como controlo as células foram apenas
incubadas com buffer. Após múltiplas lavagens, as células são incubadas com
anti-IgM e anti-IgG de ratinho à temperatura ambiente e lavadas novamente
para retirar o excesso de anticorpo. As células são observadas ao
microscópio, se possuírem antigénios na sua superfície vão emitir
fluorescência.

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MÉTODOS
• Ensaio de remoção antigénica do grupo sanguíneo B tratado com wild-
type Sp3GH98 e 5E.3-N06 mutante
• O sangue total recolhido de dadores, foi colhido para tubos com citrato e
centrifugados para separação dos eritrócitos do plasma. As células foram
lavadas com PBS, e foi adicionado soluções de enzima diluída. Foram
realizados testes de aglutinação em placa e em card. A leitura dos resultados
para a aglutinação em placa foi realizado com adição de 10µL de anticorpos
monoclonais, indicando remoção dos antigénios da superfície dos eritrócitos.
O tempo de aglutinação é determinado quando é visível a aglutinação do
eritrócitos. O ensaio foi realizado em 30 minutos de forma a minimizar o
impacto da evaporação da água nos resultados.
• Já para a o teste em card, as colunas que continham anticorpos monoclonais
de ratinho, os resultados foram recolhidos, após uma centrifugação, conforme
a mobilidade dos eritrócitos ao longo da coluna, através de valores entre 0 e
4, sendo que o valor mais elevado corresponde a uma maior antigenicidade.

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MÉTODOS
• Ensaio de remoção antigénica do grupo sanguíneo B tratado com wild-
type Sp3GH98 e 5E.3-N06 mutante
• O sangue total recolhido de dadores, foi colhido para tubos com citrato e
centrifugados para separação dos eritrócitos do plasma. As células foram
lavadas com PBS, e foi adicionado soluções de enzima diluída. Foram
realizados testes de aglutinação em placa e em card. A leitura dos resultados
para a aglutinação em placa foi realizado com adição de 10µL de anticorpos
monoclonais, indicando remoção dos antigénios da superfície dos eritrócitos.
O tempo de aglutinação é determinado quando é visível a aglutinação do
eritrócitos. O ensaio foi realizado em 30 minutos de forma a minimizar o
impacto da evaporação da água nos resultados.
• Já para a o teste em card, as colunas que continham anticorpos monoclonais
de ratinho, os resultados foram recolhidos, após uma centrifugação, conforme
a mobilidade dos eritrócitos ao longo da coluna, através de valores entre 0 e
4, sendo que o valor mais elevado corresponde a uma maior antigenicidade.

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RESULTADOS
Resumo dos Métodos e abordagens do estudo
1. “Screening” (seleção) de alta produtividade baseada num ensaio em placa
de microtitulação para a evolução dirigida do Sp3GH98.

2. Desenho e “Screening” de bibliotecas baseadas na estrutura cristalina da

enzima mãe (original) em complexo com o oligossacarídeo do Tipo 2 A.

3. Estrutura cristalina de enzimas mutantes em complexo com o oligossacárido

Tipo 1 A.

4. Desenho e “Screening” de bibliotecas baseadas na estrutura cristalina de

uma enzima mutante em complexo com o oligossacarídeo Tipo 1 A.

5. Imunofluorescência e Deteção Imunohistoquímica da remoção dos

antigénios dos grupos sanguíneos da superfície das células.

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RESULTADOS
Análise estrutural de Sp3GH98 e mutantes
(A) Estrutura de Sp3GH98E558A
em complexo com o antigénio do
grupo sanguíneo A-LeY tipo 2. Os
resíduos de a.a. escolhidos para a
aleatorização estão evidenciados a
amarelo e laranja.

Em todos os painéis, o
carboidrato é mostrado em paus
com resíduos Gal e GalNAc de cor
verde, GlcNAc de cor azul e Fuc
de cor vermelha.
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RESULTADOS
Tabela 1 - Identidade dos Mutantes e Sua Atividade contra o MU-Type1Apenta

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RESULTADOS
• O primeiro ciclo de mutagénese foi
Via evolutiva de Sp3GH98 de cinco rodadas de evolução dirigida triado de uma biblioteca de mutantes
com mutações em um dos resíduos
Tyr530, Asn559, Tyr560, Trp561, Ile562,
Asn592 e Lys624.

• Os mutantes melhorados do primeiro

round foram recombinados e, em
seguida, utilizados como um modelo
para uma segunda rodada, em que uma
biblioteca foi gerada em que os
membros tinham mutações em um dos
resíduos Tyr530, Tyr560, Trp561, Ile562
e Lys624.

• O melhor mutante do segundo turno foi

 Finalmente, o melhor mutante da quarta rodada foi submetido a
PCR propensa a erros para a quinta rodada, da qual o melhor
mutante, 5E.3-N06 foi isolado.
mutado simultaneamente em resíduos
592 e 630 para o terceiro ciclo, e os
mutantes do terceiro ciclo foram
simultaneamente mutados nos resíduos
663 e 677 para o quarto ciclo.
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RESULTADOS

Testes de imunofluorescência baseados

em anticorpos foram realizados com
substratos reais, demonstrando uma
remoção altamente melhorada de
antígenos tipo 1A da superfície dos
glóbulos vermelhos.

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Discussão
• Uma das limitações da remoção enzimática dos antigénios do grupo ABO
era a ineficiência das enzimas utilizadas para catalisar a clivagem dos
antigénios aos carbohidratos.
• Umas das abordagens foi os Polímeros moleculares.

Melhorar a atividade de reações enzimáticas na superfície celular, com

o aumento de associação e ligações das enzimas

• No entanto, não melhorava a atividade das enzimas intrínsecas.

• Outra abordagem foi engenharia enzimática através da evolução dirigida.

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Discussão
• Sp3GH98 é uma enzima que cliva as os trissacarídeo do antigénio A e B do
tipo 2.
• Por evolução dirigida foi possível especificar a enzima para permitir a
clivagem da ligação Galβ1,3-GlcNAc das cadeias do tipo 1.
• Em geral, o aumento da atividade enzimática é devido à diminuição de km.
• E em mutantes de gerações posteriores ocorre o aumento do kcat.
• Por imunofluorescência foi observado o aumento da clivagem das cadeias
A do tipo 1 da superfície das células, mas a sua remoção continuava
incompleta.

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Discussão
• A enzima Sp3GH98 remove a acetilgalactosamina e galactose terminal
dos antigénios A e B, respetivamente.
• O glicano resultante não pertence ao grupo O (antigénio H), mas em
principio não será reativo com os antigénio A e B.

Necessidade de avaliar esta reatividade pós-transfusão

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Discussão
• Em indivíduos secretores, antigénios do tipo 1 não se estão presentes
apenas na membrana eritrocitária, podendo também ser encontrados em
tecidos de origem endodérmica, como por exemplo, epitélios glandulares.

Remoção de antigénios do tipo 1 pela enzima Sp3GH98 pode vir a provar-

se útil em casos de transplantes de órgãos/tecidos, ao facilitar a
transplantação entre indivíduos ABO incompatíveis.

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Discussão
• Por meios de evolução dirigida, é possível aumentar a especificidade da
Sp3GH98 para clivar as ligações Galβ-1,3-GlcNAc das cadeias tipo 1,
retendo a especificidade pelas ligações Galβ-1,4- GlcNAc das cadeias tipo
2.
• Isto representa a possibilidade de se conseguir alargar a especificidade da
Sp3GH98 para clivar as ligações Galβ-1,3-GlcNAc das cadeias tipo 3 e 4
por vezes presentes em antigénios A.

Possibilidade de remover completamente antigénios do tipo ABO da

superfície eritrocitária com recurso a uma única enzima.

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Conclusão
• A remoção enzimática de antigénios eritrocitários traduz-se num método que
pode permitir a realização de transfusões sanguíneas entre indivíduos
incompatíveis.
• No entanto, a utilização de enzimas glicosidases encontradas na natureza ainda
apresenta algumas limitações na aplicação deste método.
• Este trabalho demonstrou que a evolução dirigida destas enzimas pode servir
como meio para a obtenção de sangue universal.

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