Universidad Autónoma de Yucatán

Facultad de Química

Integrantes:
• Anaelí del Ángel Silveira Arcila
• Melissa Guadalupe Morales Chuc
• Maureen Marian Moguel Jiménez Práctica 8
• Paola Cristhell Tejeda Gaytán
• Nilane Guadalupe May Pinto
Electroforesis de proteína
• Elsy Verónica Azcorra Ventura (SDS-PAGE)
• María del Carmen Sobrado Magaña

Profesor: Jesús Gilberto Gómez Carballo

25 de octubre del 2018
 Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de
la técnica que se use.

Esquema de cubeta de
Esquema de cubeta de electroforesis horizontal
electroforesis vertical
 Técnicas Electroforéticas
• Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE): el capilar es recorrido por el
electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido, básico o anfótero (carácter
ácido y básico)

• Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC): se añade a la fase móvil un

compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Utilizado en moléculas que
tienen tendencia a migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiómeros
 Técnicas Electroforéticas
• Electroforesis capilar en gel (CGE): Esta es la transposición de la
electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno
con un electrolito que contiene al gel.

• Isoelectroenfoque capilar (CIEF): consiste en crear un gradiente de pH lineal

en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero
 Electroforesis vertical con gel de acrilamida
SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sódico.
• La muestra se trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y se calienta
brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización.
Se suele añadir también β-mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las
subunidades de la proteína y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.

• En la preparación del gel se mezclan:

 un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)
 acrilamida y bisacrilamida
 un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato amónico (genera radicales libres)
 un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina)
 SDS
Permite obtener una estimación de la masa molecular de las
proteínas separadas.

Para controlar el avance del frente de electroforesis se añade

a la muestra un colorante marcador, molécula cargada y de
pequeño tamaño que avanza más que cualquier componente
de la muestra; el más habitual es el azul de bromofenol.
 Electroforesis discontinua
• Para mejorar la resolución (obteniendo bandas más
compactas) se suele emplear electroforesis discontinua, en
donde hay dos geles de distinta porosidad y pH:
1. En la parte superior, un gel acumulador o concentrador,
que tiene como efecto concentrar la muestra en una banda
estrecha.
2. Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador en el
que tiene lugar la separación de los componentes.
 MATERIALES Y REACTIVOS
Fuente de electroforesis
Baño de incubación
 Cubeta de electroforesis con cristales, peines y
separadores.
Formador de geles
Pipetas
Solución de acrilamida/bisacrilamida: Contiene 30%
acrilamida + 0.8%
bisacrilamida preparada en agua destilada
Disolución de SDS: 10 % en agua destilada
Disolución de persulfato de amónico: 100 mg/mL en agua
destilada
TEMED (solución comercial)
 MATERIALES Y REACTIVOS
 Buffer del gel separador: Tris 1M; pH = 8,8
 Buffer del gel acumulador: Tris 0,5 M; pH = 6,8
 Buffer de Carga 5X: 2,5 ml de solución de SDS 10%; 0,2 ml de 2-
mercaptoetanol; 0,5 ml de azul de bromofenol 0,05%; 0,3 ml de
Buffer de electroforesis; 1 ml de glicerol y 0,5 ml de Tris 0,5 M pH
6,8.
 Buffer de electroforesis: contiene 14,4 g/l de glicina, 3 g/l de Tris
(base) y 10 ml/l
 de SDS 10%.
 Marcadores preteñidos de peso molecular
 MONTAJE DEL SISTEMA DE ELECTROFORESIS
Se utilizará un gel
INICIO plano de 1,5 mm
de grosor
Primero se polimeriza
el gel separador
Con una pipeta Pasteur
rellenar con la mezcla
liquida el espacio entre las
dos placas hasta unos 3 cm
del borde sup.
montar el “sandwich” dos “separadores” en
con dos placas de vertical entre ellas y a
vidrio ambos lados.
Los geles se preparan
Usar guantes y
pipetear con mezclando, en un vaso de
precipitados, los componentes
propipeta.
indicados en la tabla
Añadir agua destilada y
Volcar para retirar el
esperar a que
agua destilada. Secar
polimerice el gel
con un papel de filtro.
(30-60 min)
formará en el gel
concentrador los pocillos
FIN
para luego poder aplicar las
muestras.
Introducirlo en el soporte
formador de geles.
Sujetar el conjunto.
Se empleará un gel
separador con un 7,5 % de
acrilamida y un gel
acumulador con un 4 % de
acrilamida.
Añadir sobre este gel
separador la mezcla del
gel concentrador
y antes de que
polimerice introducir en
la parte superior el
“peine”
SEPARACION DE LAS PROTEINAS POR SDS-PAGE
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
añadir a la muestra Utilizar un tubo con 10
Una vez polimerizado el Buffer de carga 5X en μL de patrones
INICIO tomar 24 μl de la
gel concentrador se una relación 4:1 (V:V) (6 preteñidos de peso
solución con la proteína
aplica la muestra. μl) molecular conocido.

Sacar del formador de Centrifugar los tubos a Mantener las muestras

6. Retirar con cuidado el
geles el “sandwich” de baja velocidad durante durante 5 minutos a 100
peine al gel
placas de vidrio, un minuto ºC.
concentrador
separadores y gel

Llenar las cámaras superior e inferior

Con la micropipeta Se completa cada pocillo
de la cubeta de electroforesis que anotar el orden de
aplicar las muestras y los con buffer de carga 1X.
contienen los electrodos con Buffer de aplicación de las
patrones de PM en los Se añade a los pocillos
electroforesis, de modo que entre en muestras
pocillos de gel vacíos.
contacto con ambos extremos del gel.

identificar el gel en el que están

FIN las muestras que corresponden a
cada taquilla.
DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS

Conectar los cables de la cubeta Aplicar 80 V hasta que el Cuando el frente,

a una fuente de corriente frente entre en el gel
INICIO desconectar la corriente y
continua [comprobar la separador; después subir a sacar el sándwich
polaridad: rojo (+), negro (-)]. 120 V.

Com azul de Coomassie, ácido Una vez finalizada la Separar las placas de vidrio
acético, metanol durante 2 transferencia, se tiñe el gel con ayuda de una espátula
horas a temperatura ambiente. de electroforesis y sacar el gel

pasa el gel a solución de

distinción que contiene ácido
acético 10% y metanol 10% en FIN
agua, destiñendo el gel durante
toda la noche.
Figura. Método de preparación de geles de poliacrilamida y
tinción de Coomassie.

1. Se coloca la mezcla: Separado y se deja polimerizar.

2. Ya polimerizado se retira el iso-propanol y se coloca la
mezcla concentrador.
3. Se abrocha el cassette en los electrodos y se coloca el
buffer de corrida.
4. Se coloca la tapa , se conecta y se programa a la fuente de
poder.
5. Se retira el gel y se tiñe con Coomassie toda la noche. Al
retirar del Coomassie se lava para quitar el exceso y se
escanea con un densitometro.
DIAGRAMA ECOLÓGICO
GEL SEPARADOR (7.5%)
R1
DISOLUCIONES ACUOSAS ORGÁNICAS

GEL CONCENTRADOR (4%)

R2
DISOLUCIONES ACUOSAS ORGÁNICAS