Determinação de Princípios Ativos por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Adriana Passos Oliveira

 HISTÓRICO
• 1903 - Michael Tsweett (Pai da cromatografia. Separou corantes vegetais usando
carbonato de cálcio).

• 1941 - Martin, Synge (Prêmio Nobel de C.G.).

• 1967 - ATUALIDADE - Desenvolvimento da técnica.

CROMATOGRAFIA

• Método de separação de misturas em seus componentes individuais.

• As separações são dependentes das diferenças de afinidade das substâncias

pela FM e pela FE.

♦ FM – Geralmente um Líquido (CL) ou um gás (CG).

♦ FE – Geralmente sólida ou líquida.

 Fundamentos da Separação Cromatográfica

FM – Transporta a amostra através da FE. A interação da FE com os

componentes individuais da mistura promove a separação.

FE – Interage com os componentes da mistura. Esta interação é

diferente para cada componente, assim os componentes são separados
em diferentes tempos e a medida que eles passam pelo detector,
quando a coluna é suficientemente longa.

Exemplo de mistura complexa: extrato vegetal.

 CROMATOGRAFIA

• Tipos de cromatografia:
– Adsorção, partição, troca iônica, filtração molecular, etc.

• Técnicas de cromatografia:
– Cromatografia em papel, camada fina, cromatografia em
coluna, cromatografia em fase gasosa (GC),
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), entre
outras.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
 1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
• O mecanismo de retenção da amostra por adsorção é a competição
entre soluto e FM pelos sítios ativos da FE.
• Método útil para solutos de baixa ou média polaridade com PM 5000.
 1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)

a) Fase Ligada:

A superfície da Sílica (altamente polar) é alterada pela adição de

diversos grupos funcionais → diferentes tipos de seletividade.

Adição de grupo polar (-NH2, -CN) - FASE NORMAL.

Adição de grupo apolar (-C8H17 , -C18 H37 , -C6H5) - FASE REVERSA.

FASE NORMAL FASE REVERSA

Polaridade da FE Alta Baixa
Polaridade da FM Baixa-média Alta-média
FM Típica Hexano/ CHCl3 CH3OH : H2O
Ordem de eluição Menos polares primeiro Mais polares primeiro
Para aumentar o tR dos solutos Diminuir a polaridade da FM Aumentar a polaridade da FM
Para diminuir o tR dos solutos Aumentar a polaridade da FM Diminuir a polaridade da FM
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
FASE NORMAL

Superfície polar
Fase móvel apolar
Amostra com
ou de pouca
Sílica polaridade de
polaridade.
baixa a média
Ex:
Hexano/isopropanol
Heptano/clorofórmio
Ex: Sílica
Amino
Ciano Grau de retenção
Diol depende da polarização
de cada molécula
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)

FASE REVERSA

Superfície Apolar
Fase móvel polar
Amostra com
Sílica Ex:
polaridade de
MeOH/H2O
alta a média
CH3CN/H2O

Ex: ODS(C18)
C2, C6,C8
Ciclohexil
Fenil, diol
 1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
Estrutura das Fases Ligadas à Sílica para CLAE
Amino Ciano, CN, Nitrila
R R
O Si (CH2)3NH2 O Si (CH2)3CN
R R

ODS, C18 Octil, C8

R R
O Si (CH2)17CH3 O Si (CH2)7CH3
R R

Fenil
R
O Si (CH2)3
R
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)

b) Fase quiral

- Separação de enantiômeros

• Formação de complexos diastereoisoméricos com um

seletor quiral adicionado à FM e posterior separação
por coluna não quiral.

• Separação em FE quiral (método direto)

 2 - CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO (líquido – líquido)
• Desenvolvida por Martin & Synge (1941) para a separação de vários
ácidos aminados.

• O mecanismo de separação baseia-se nas diferentes solubilidades

dos componentes da mistura entre a FM e a FE.

• Os componentes mais solúveis na FE são seletivamente retidos por

ela, enquanto os menos solúveis são transportados mais
rapidamente pela FM.

• Substâncias com PM < 2000.

• Ex: FE de água em sílica (suporte) e CHCl3 como FM
3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)

• Usada para substância com cargas. (Ex: Ácidos carboxílicos,

açúcares, analgésicos, vitaminas, ânions inorgânicos, cátions
metálicos, peptídeos, ácidos aminados e ácidos nucléicos.)

• A separação depende da força iônica, cargas, pH.

• FASE ESTACIONÁRIA: resina de poliestireno entrecruzada com

divinilbenzeno → onde são ligados grupos iônicos que podem ser
aniônicas (grupos amino) ou catiônicas (ácido carboxílico ou
sulfônico).
X+ + R- Y+---> Y+ + R-X+ (NR3).
X - + R+Y- ---> Y- + R+X- (SO3-/COO-).

Ex:
Si C H2 S O3-
 3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)

- A molécula da amostra iônica ou ionizável forma um par de íons por

associação com um contra-íon orgânico, adequado, da FM.

- O par iônico é então distribuído entre a FE, normalmente uma fase

reversa, onde o par iônico é solúvel, e a fase móvel, normalmente
aquosa-orgânica, que solubiliza as espécies ionizadas;

Equilíbrio entre o contra-íon Na+ e

o cátion da amostra M+
Os grupos iônicos apresentam um
contra-íon que pode ser deslocado pelos
íons da fase móvel de mesma carga.

Resina trocadora de cátions

M+ + R-SO3- Na+ ↔ Na+ + R-SO3- M+
 3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)
• Avanços em cromatografia de troca-iônica incluíram o desenvolvimento
de:
1 - Resinas peliculares possuem capacidade reduzida, da ordem de 10µ g /
g, porém muito eficientes. Podem ser utilizadas com solventes orgânicos.

2 - Resinas porosas (tradicionais) são usadas na separação de ácidos

aminados, peptídeos e carboidratos. Possuem capacidade elevada, da ordem
de miliequivalente/g de material e têm a vantagem de resistir a pressões
elevadas e possuir uma capacidade de troca superior a dos materiais
peliculares
Ex: Trocador aniônico (Aminex A series - es-dvb-NR3+) → 3,2 meq/g
Trocador catiônico (Aminex A series - es-dvb-SO3-) → 5,0 meq/g
 3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)
Um alto grau de seletividade pode ser introduzido na separação pelo
ajuste de temperatura, pH, polaridade da FM, natureza e concentração do
contra-íon e pela natureza da FE.

a) Temperatura:
• Temperaturas elevadas das colunas são utilizadas para aumentar a
velocidade e a resolução da análise cromatográfica.
• Em cromatografia de T.I. são usadas temperaturas de 25° a 80 °C.

b) pH:
• A retenção relativa e o tamanho máximo da amostra, em cromatografia de
T.I., aumentam com a capacidade de troca-iônica da coluna.
• Esta capacidade é proporcional a concentração de grupos iônicos R (+/-)
dentro da partícula, PORÉM, VARIA EM FUNÇÃO DO pH.
• Em pH baixo, trocadores de cátions são neutralizados pela adição de
próton:
R- + H+ ↔ R-H+
• Em pH alto, trocadores de ânions são neutralizados por bases:
R+ + OH- ↔ R+OH-
Capacidade de troca 1- A capacidade tende a zero em
Trocador catiônico forte 1 pH baixo – não podem ser
usados em pH ≤ 1.
Trocador aniônico forte 2 2 – A capacidade tende a zero
em pH ≥ 10. Podem ser
empregados apenas abaixo de
pH 11.
2 4 6 8 10 12 14
pH
3- Devem ser usados acima de
3 Trocador catiônico fraco pH 6.
Capacidade de troca

4 4- Estão limitados a pH ≤ 8.
Trocador aniônico fraco
• Estes efeitos são resultado do
aumento da competição nos
extremos de pH, tanto do íon
H+ quanto do OH-, pelos sítios
de troca iônica, resultando na
exclusão de íons da amostra
destes mesmos sítios.
2 4 6 8 10 12 14
pH
3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)

- Os trocadores iônicos fortes podem ser usados em uma extensão

maior de pH do que trocadores iônicos fracos, revelando a maior
popularidade no uso de trocadores fortes.

- Como resultado, uma grande variedade de classes de substâncias

podem ser separadas por trocadores iônicos fortes, podendo ser
analisadas em um único gradiente de pH.

- Substâncias que são fortemente retidas e que não toleram extremos de

pH devem ser analisadas por resinas com trocadores iônicos fracos.
 c) Fase Móvel:

a) Deve fornecer solubilidade adequada para os vários sais e tampões

necessários para a troca iônica;

b) Controlar a retenção da amostra pelo uso correto da força do

solvente;

c) Fornecer seletividade na retenção.

- As separações por troca-iônica são freqüentemente executadas com

soluções salinas aquosas, sendo normalmente tamponadas e contendo,
em alguns casos, quantidades moderadas de solventes orgânicos
solúveis em água, como MeOH e acetonitrila.
4 - CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (líquido – sólido)

• Separação de acordo com o tamanho da molécula.

• Uso para separação de amostras de alto peso molecular (>2000).

• As moléculas menores (menor PM) penetrarão mais nos poros,

sofrendo mais retenção e saem depois e as moléculas maiores
passam por fora dos poros e saem primeiro.

• FE é um material inerte com tamanho

de poros diferentes e controlados

• Materiais empregados: copolímero de

ES-DVB; vidro poroso;
4 - CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (líquido – sólido)

√ Análise de polímeros orgânicos:

Ex. poliolefinas, poliestirenos, poliamidas, silicones

√ Análise de biopolímeros:
Ex: proteínas, ácidos nucleicos, oligossacarídeos,
peptídeos, açúcares e glicóis
 Sistema de solventes tipicamente usados

Hexano, diclorometano,
ADSORÇÃO clorofórmio, metanol,
acetonitrila
Metanol/água
FASE REVERSA Acetonitrila/água

TROCA-IÔNICA Tampão aquoso

PERMEAÇÃO EM GEL Tetrahidrofurano, tolueno

PROCEDIMENTOS E APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
- Seleção de acordo com o PM, solubilidade, polaridade e
grau de ionização das substâncias.

Polaridade
Insolúvel em água Solúvel em água
Apolar Iônico
Polar não-iônico

Partição
10 2

Adsorção Troca
FR FN Iônica
Peso Molecular

103

104
Exclusão
105 Permeação Filtração
em gel em gel
106
 Modalidade FE
CLS Sílica
Apolar
Propriedades CLFL-FR C-18
Peso Molecular
CLFL-FR
Insolúvel em C-8
Moderadamente
água polar

< 2000 CLS Sílica

Polar CLS Sílica

CLFL-FN CN
Amostra CLFL-FR C-8
Solúvel em Não-iônico
água CLFL-FR C-18

Trocador
Base Forte CTI de cátions
CLFL-FR
Base Fraca C-18
Iônico Pares de íons
Trocador
Ácido Forte CTI de ânions

CLFL-FR
Ácido Fraco C-18
Pares de íons
 Modalidade FE

Insolúvel em água CE Gel de

Poliestireno

> 2000
CE Gel de
Não-iônico
Dextrano

Solúvel em água

Iônico CTI ES-DVB

 Cromatografia Líquida Clássica

Vantagens: Limitações:
Amostra Solvente
- Baixo custo -Análise Lenta
-Método simples - Baixa Resolução
Separação
Coluna dos
- Bom método componentes - Dificuldade de
de vidro da amostra
Preparativo quantificação

-A vazão do eluente é promovida pela ação da gravidade;

- As frações individuais são coletadas manualmente ou através de um coletor de frações;
- O recheio da coluna é normalmente utilizado uma única vez → adsorção irreversível de parte
da amostra;
- O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separação;
- A aplicação da amostra requer alguma habilidade do operador;
- Análise lenta;
- Detecção e quantificação são realizados por análise manual das frações, individualmente;
- O número de frações coletadas é grande e o processamento requer muito tempo e esforço;
- Em geral, emprega-se alguma técnica auxiliar, como espectrofotometria, análise química, ou
simplesmente o registro gravimétrico.
 cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)

• Capacidade de separação bem elevada.

• Separações à temperatura ambiente.
• Não está limitada à volatilidade ou estabilidade térmica da substância.
• Rapidez e reprodutibilidade das análises.
• Amostras não são destruídas pelo detector e podem ser coletadas e
utilizadas puras.
As FE para CLAE são micropartículas porosas (3,5 e 10 µ m):
- quanto a forma: esféricas ou irregulares
- quanto a uniformidade de tamanho: homogênea ou heterogênea
Cromatografia Líquida de Alta Resolução

HPLC OU CLAE
FILTRAÇÃO DO SOLVENTE:

FILTRAÇÃO DA AMOSTRA
 Fase Móvel
- Deve ser degaseificada;
- Velocidade de fluxo entre 0,1 – 10 mL / min.
- Bomba de alta pressão ( 6-10.000 psi)

Injeção da amostra
- Alça (loop) de amostragem / Válvula de Injeção
- Volume de Injeção: 5 – 500 µ L
 RESERVATÓRIO DE
SOLVENTE

• Local onde se acondiciona a fase móvel.

• Solvente de alto grau de pureza, filtrado e
desgaseificado (ultrasom, vácuo, hélio).
• Mais usados: Acetonitrila, metanol, água, hexano,
isopropanol (pode-se adicionar um pouco de ácido
(TFA ou ác. fosfórico) ou base (aminas) para facilitar a
eluição).
• Solvente deve ser de baixa viscosidade, compatível
com o detector utilizado, polaridade adequada.
 COLUNA

• Resistentes a altas pressões.

• Reutilizáveis
• Inerte a solventes
• Não apresentar volume morto.
• Coluna de guarda (pré-coluna) - Para
proteção da coluna principal
 BOMBA INJETORA

• Permite a passagem da fase móvel por

colunas altamente compactadas.
• Fluxo contínuo e livre de pulsações.
• Isocrático: Uma só bomba
• Gradiente: Uma só bomba - Solventes
combinados previamente a baixa pressão.
• Duas ou mais bombas -Mistura a alta
pressão.
 INJETOR
• Colocado entre a bomba e a coluna, responsável pela entrada da
amostra a ser separada no sistema.

• Deve ser de material inerte (teflon e aço) e resistir a altas pressões.

• Amostra é injetada em LOAD, entrando em um compartimento

chamado de LOOP (pode ser de vários volumes). Quando se quer
injetar, vira a chave para a posição INJECT e o fluxo é desviado para o
LOOP carreando a amostra.
da bomba

para a
coluna

Alça de
amostragem

Seringa
 Detectores utilizados em CLAE

1- Características gerais:

• Sensibilidade → baixo limite de detecção

• Linearidade
• Seletividade ou Universalidade
• Estabilidade
• Volume de cela
• Destruição do soluto
• Custo, Praticidade, Aplicabilidade

2- Detector UV/Vis
DETETOR UV

• Onda fixa Onda variável Diode array

• Mede a absorção UV das substâncias (nem sempre o
maior sinal é da substância majoritária).
• Usar no λ de maior absorção da substância.

cromatograma
LUZ
+
UV
prisma
HPLC/UV do Extrato Metanólico
de Hypericum brasiliense
HPLV/UV/MS/NMR
HPLC/UV/MS/RMN de Extratos de
Gentianaceae
 OUTROS DETECTORES

Detector de IV
• Absorção de luz IV → movimentos vibracionais das moléculas;
• Universal e não destrutivo;
• Pouca sensibilidade e necessidade de evaporação do solvente.

Polarímetro e Dicroísmo Circular

• Efeito da luz plano-polarizada sobre a substância;
• Específico para substâncias quirais.

Fluorescência:
Alta sensibilidade, porém restritos às substâncias fluorescentes (muito
seletivo).

Índíce de Refração:
Detetor universal. Altamente instável (pulsações, temperatura,
eletricidade). Não se pode usar gradiente.
ANÁLISE QUALITATIVA
Exemplo
Álcool
desconhecido

A análise qualitativa
pode ser realizada
através da correlação
entre os TR de
substâncias
desconhecidas com
padrões analisados
sob as mesmas
Padrão
condições
experimentais
 O Coeficiente de Partição (K)
• Permite quantificar a distribuição da substância entre a fase
estacionária e a fase móvel

K= SFE / SFM
↑K = A substância permanece na FE por mais tempo
A substância permanece na coluna por mais tempo

Tempo de eluição aumentado = ↑K

Assumindo que K é constante para uma substância sob
condições cromatográficas (Constante termodinâmica)
 CROMATOGRAMA DA AMOSTRA

Comportamento de Retenção

Tempo de retenção (TR): Não é uma medida consistente da afinidade relativa

de uma substância pelas fases estacionária e móvel pois varia em função da
velocidade de eluição, temperatura, entre outros, sendo possível determinar
assim o Fator de capacidade (k´) – Tempo de retenção corrigido;
tM = tempo em que as moléculas do
K´= tR - tM
soluto ficam na fase móvel.
tM
tR = tempo em que as moléculas do
soluto ficam na fase estacinária.
 Largura do Pico
• É governado por processos cinéticos que depende:
a) difusão da substância ao longo da coluna cromatográfica – quanto
maior o coeficiente de difusão, maior a velocidade de eluição do soluto
(menor a largura do pico).
b) transferência de massa – quanto mais rápido o processo de
particionamento, menor a largura do pico.
A) Difusão
- Se aplica somente a colunas empacotadas com partículas (suporte
sólido no qual a FE está adsorvida);

- Cada substância atravessa um caminho diferente através das

partículas:

Difusão ↓ com ↓ diâmetro da partícula

 B) Transferência de Massa
(Fase Estacionária)

-A velocidade na qual uma substância se particiona dentro e fora da

fase estacionária afetará a largura do pico.

- Quanto mais rápido o processo de particionamento, menor a

largura do pico pois fica menos tempo retida

Logo, o processo de particionamento é dependente do tempo

 Pratos teóricos

A eficiência de uma coluna / poder de separação está ligada ao número de pratos

teóricos, quanto maior o número de pratos teóricos maior será o equilíbrio da
amostra entre as FASES MÓVEL E ESTACIONÁRIA.
Um prato teórico corresponde a uma etapa de equilíbrio entre as FM e FE.
O analito move-se ao longo da coluna através de sua transferência, em equilíbrio
com a fase móvel, de um prato teórico para outro

A altura de um prato teórico é relacionada ao comprimento da coluna com o

qual uma única separação é alcançada.

Logo, a eficiência da coluna pode ser relacionada a altura do prato teórico (H);

E, o poder de separação da coluna pode ser avaliado pelo número de pratos

teóricos (N), onde:
N=L/H
L= Comprimento da coluna e H = altura do prato teórico
 - Como podemos definir resolução?
Resolução
W = largura do pico
Z = distância dos picos

Valores de RS versus Separação

 Quais são os objetivos do método?

 Obtero Máximo de Resolução

 Menor intervalo de tempo

-Melhor resolução é obtida com um número máximo de pratos teóricos:

-Como aumentar o N?
 Otimizando a velocidade de vazão da FM
 Aumentando o comprimento da coluna (L)

 Porém, Ambos aumentam o tR

Diminuição da altura do prato teórico (H)

- Aumenta a eficiência da coluna;
- Não sacrifica o tR (tR ∝ H)
 Melhor resolução é obtida com o aumento de K´

Como aumentar K´?

-Como o K´é relacionado a termodinâmica do processo de partição:
- Mudanças:
1- Composição da FM
2- Composição da FE

Então, como podemos ter uma boa resolução de todas as substâncias

em uma mistura na qual há uma grande variação dos valores de K´?
Sinal do soluto
 A Solução:
- Variação dinâmica da composição da FM com o progresso da separação.
Gradiente de Eluição

(a) Gradiente de eluição

(b) Eluição isocrática

 ANÁLISE QUANTITATIVA
Uso da área do pico como o sinal que melhor se correlaciona com a
concentração do analito.

Análise Direta:

-Curva de calibração: Plotagem da área do pico em função da

quantidade (volume ou concentração) do analito.

- Determinação da concentração do analito em amostra desconhecida

através da correlação entre a área do pico e a quantidade do analito na
curva de calibração.
 Curva de calibração
• Capacidade de se obter resultados diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo específico

• No mínimo 5 concentrações diferentes, dentro da seguinte faixa:

– análise de fármacos e medicamentos: 80 - 120% da concentração
teórica;

• Cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados,

mostrando o coeficiente de correlação linear e o intercepto da reta.

• Valor mínimo aceitável do coeficiente de correlação: (r) deve ser = 0,99

 Curva de calibração
Problemática: grandes variações do sinal (pouca precisão) devido a falta
de exatidão na injeção da amostra.
- velocidades de injeção variáveis
- variações de volume

Exemplo:

RSD – Desvio Padrão Relativo

Solução: Uso de Padrão Interno

Adiciona-se uma concentração conhecida / fixada de uma substância

(padrão interno) a todas as amostras e padrões utilizados na análise.

-Correlaciona-se todas os valores de área do pico, tanto do padrão

quanto da amostra, aos valores da área do pico do padrão interno.

- Se o padrão interno se comporta da mesma forma que o analito,

então ele deverá experimentar as mesmas condições e exibir as
mesmas flutuações de sinal.

- O Padrão interno deverá apresentar o mesmo comportamento de

retenção do analito.
 PADRONIZAÇÃO INTERNA
• Não pode estar presente na amostra a ser quantificada

- Deve ter comportamento cromatográfico similar ao da substância a ser

analisada

- Deve absorver na mesma faixa da substância a ser analisada

- Deve estar em uma concentração conhecida

- Adição de uma quantidade exatamente conhecida de uma substância

denominada padrão interno, tanto à amostra como ao padrão;

- É o método menos sensível à erros de injeção, erros de diluição, erros

relacionados ao preparo das amostras, variações instrumentais, etc., uma
vez que estes erros são compensados pela utilização das relações entre
as áreas;
Área padrão/ Área do PI = Área do analito / Área do PI
Concentração do Padrão Concentração do Analito
 PADRONIZAÇÃO INTERNA
• Cálculos realizados com a razão entre as áreas do analito e do PI – anula
possíveis erros de injeção.

Sx/Spi X Cx/Cpi
 PADRONIZAÇÃO EXTERNA
• Preparação de padrões (substância de referência) de concentração
semelhante ao analita na amostra, e o ensaio cromatográfico de ambos
nas mesmas condições de operação.

- É o método mais utilizado em CLAE

- A exatidão do método depende da qualidade do padrão.

- A precisão depende da preparação das soluções e das injeções.

- Calcula-se a concentração pela equação ou pela curva de calibração.

Intensidade do sinal do padrão = Intensidade do sinal do analito

Concentração do padrão Concentração do analito
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Os Requisitos para uma quantificação exata e precisa:
- Boa resolução dos picos: cada pico representa apenas uma
substância;

- Não poderá haver adsorção e/ou decomposição das substâncias no

sistema cromatográfico;

- Existência de substâncias de pureza confiável para serem usadas como

padrões – identificação e fator de correção da área;

- A amostra a ser analisada deve ser representativa do total;

- Não deve haver perdas no preparo;

- Não deve haver contaminação;

- Técnica de injeção correta;

- A temperatura e vazão da fase móvel não deve alterar a resposta do

detector;
 Bibliografia

COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L. Introdução a métodos

cromatográficos. 5 ed. Campinas: UNICAMP, 1993.