UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, Decana de América

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

E.A.P FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Integrantes:
Asesora: Dra. • ALVARADO BARZOLA, Fernanda • GONZALES AMAYA, Anibal Rafael
Amparo Iris Zavaleta Diuvina • ORTIZ ORTIZ, Antonieta
Pesantes • BRAVO ORTIZ, Cristina Del Pilar • PINEDA NÚÑEZ, Jhonn
• GABRIEL MARCELO, Joshep Arturo • TORRES CARRERA, Geminiss Karely
Introducción
 El gen β2AR se encuentra en el cromosoma 5q31

 El gen β2AR se expresa en diversos tejidos y órganos del cuerpo.

El β2AR responde a la acción de la adrenalina y la noradrenalina, promueve la relajación del

músculo liso, incluso en la región pulmonar juega un papel importante en la broncodilatación
durante el ejercicio en sujetos sanos, asimismo en el metabolismo de lípidos y CHO.

Los polimorfismos en el gen β2AR relacionados con los síntomas del asma, incluyendo reducción
de la función pulmonar y la respuesta a la medicación broncodilatadora
son Arg16Gly y Gln27Glu

Los polimorfismos del gen β2AR que codifica al receptor b2 adrenérgico son sustitución de la
isoleucina 164 por treonina (Ile164Thr), la sustitución de una arginina por una glicina en el
aminoácido 16 (Gly16Arg), o la sustitución de una glutamina por un glutámico en el aminoácido
27 (Glu27Gln).
 POLIMORFISMO
El polimorfismo a tratar, en el gen
receptor adrenérgico beta 2, se basa
en la sustitución de nucleótidos
individuales, estos corresponden a la
sustitución de Arginina por Glicina en
el aminoácido 16 del receptor.
ANTECEDENTES
La evidencia muestra que
los cambios en la
secuencia aminoacídica de
los receptores
adrenérgicos β2 pueden
modular la gravedad del
asma y la respuesta al
tratamiento.
Se ha encontrado que los asmáticos con genotipo homocigótico Arg16Arg
que reciben corticosteroides inhalados no experimentan cambios en el
estado de hiperreactividad incluso cuando se utilizaron agonistas β2 de
acción prolongada, en cambio, la combinación de salmeterol más
corticosteroide inhalado en los pacientes Gly16Gly, produjo una
disminución de la hiperreactividad bronquial.
el heterocigoto Arg26Gly son mayores en población asmática con un (55.2%
en pacientes y 35% en controles) pero a la vez poseen mejor respuesta
broncodilatadora con salbutamol que los homocigotos, y estos homocigotos
asmáticos tienden a ser más sensibles a los alérgenos.
 JUSTIFCACIÓN
El polimorfismo en el gen β2AR en los alelos Arg16Gly se ha asociado con en el asma y tienen una frecuencia de 0.39, 0.50,
0.40 en caucásicos, afroamericanos y poblaciones de Asia respectivamente; y en Sudamérica se obtuvieron asociaciones
significativas.

En el Perú existe investigaciones realizadas en donde la prevalencia de asma en 1996 fue de 15,4% y 15,3% en niños de 6 a 7
años y de 13 a 14 años respectivamente. En el 2007, en área urbana de alta pobreza, 23,2% de síntomas sugestivos de asma.
En el 2009 en Ica de 13,5% predominando ligeramente en los niños menores de 5 años en 39% y 16 y 7% para 6 a 10 y 11 a
14 años respectivamente. Por lo que se infiere que esta enfermedad es prevalente, sobre todo en niños y que se incrementa en
el tiempo.

Estos factores han servido para identificar una fuerte problemática en la prevalencia del asma; por lo que es de importancia el
estudio genético del polimorfo Arg16Gly para prevenir enfermedades relacionadas con esta. Asimismo, incrementar la base
de datos genéticos del país. Este objetivo se puede alcanzar haciendo un estudio de la frecuencia que tiene el polimorfismo
(Gly16Arg) del gen β2AR en la población más cercana al estudio; es decir en los estudiantes de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica mayores de 18 años y relacionar este polimorfos (Gly16Arg)
con algún episodio de asma en dicha población.
HIPÓTESIS
Es probable que se encuentre el polimorfismo Arg16Gly en
el gen del receptor adrenérgico Beta 2 en los estudiantes de
la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
OBJETIVOS:
PRINCIPAL:
Determinar la frecuencia del polimorfismo Arg16Gly en el gen receptor adrenérgico
beta2 en estudiantes de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de UNMSM.

ESPECÍFICOS:
Estandarizar la técnica PCR-RFLP para la determinación del polimorfismo Arg16Gly en
el gen receptor adrenérgico beta 2.
 Determinar el polimorfismo Arg16Gly del gen receptor adrenérgico beta 2 mediante
PCR-RFLP.
Correlacionar los perfiles PCR-RFLP de los estudiantes con la patogénesis del asma.
Extracción de ADN
Mezclar por inversión (P1)
20 µL proteína K
Mezclar lentamente (P2)
Adicionar 400 µL de Mezclar lentamente (P3)
200 µL muestra de
sangre solución de lisis.
Obtención de una Incubar a 56ºC
Muestra P4
mezcla homogénea por 10 min. PRODUCTO 5
200 µL etanol Transferir P3 a una
absoluto columna de
intercambio iónico Adicionar 500 µL de
buffer lavado WBL a
a un tubo limpio. 1000 rpm por 1min.
Centrifugar 8000 Adicionar 500 µL de
por 1 min. buffer lavado WBII a la
columna a 13000 rpm
Descartar el por 3min.
centrifugado. En cada operación se
descarta el centrifugado
cambiando el tubo de
microcentrifugación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Para las amplificaciones PCR del DNA genómico se realizó una
reacción de 25 ul que contenía 2 ul de DNA genómico y 23 ul de
una mezcla de los componentes

La mezcla contenía: dNTP, buffer de reacción (50 mM de KCI tris-

HCI, pH 8.4), MgCI2, Taq ADN polimerasa, DMSO y el "primer",
con las siguientes secuencias 5’-GCCTTCTTGCTGGCACCCCAT-3’
(sentido) y 5’-CAGACGCTCGAACTTGGCCATG-3’ (antisentido)

Se amplificó un fragmento de 168 bp que incluye el sitio

polimórfico.

Para el alelo A46G las reacciones se incubaron por 5 min a 95°C,

seguidas por 35 ciclos a 95°C por 30 s, 60°C por 30 s, 72°C por 30
s, con una extensión final a 72°C por 5 min.

-Paola Cadena C. Caracterización de los polimorfismos Arg16Gly16 y Gln27Glu del β2-adrenoreceptor en adultos
Colombianos y su asociación con el asma. [Tesis] Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 2012
-Martinez FD, Graves PE, Baldini M, Solomon S, Erickson R. Association between genetic polymorphisms of the 􀀀 2-
drenoceptor and response to albuterol in children with and without a history of wheezing. J Clin Invest 1997;100:3184-
3188.
 RFLP
Secuencia de corte
NcoI: C*CATGG
Para evidenciar el polimorfismo se tomaron 10 μl del producto de la
PCR de 168 pares de bases, con 0.5 UI de NcoI en 10 μl de Buffer de
reacción (acetato de potasio 25 mM de , Tris acetato 10 mM pH 7.9,
acetato de magnesio 5 mM , DTT 0.5 mM y MgCl2 16.7 mM )

Todo el contenido se incubó a 37 ºC por 12 horas. Los fragmentos

digeridos se separaron en gel de agarosa al 2%

De esta forma la digestión mostró fragmentos de 146 y 22pb con

genotipo A/A (Arg16Arg), genotipo A/G, Arg16Gly los fragmentos
fueron 146, 128,22 y 18pb y genotipo G/G; Gly16Gly los fragmentos
fueron128,22 y 18pb.

-Paola Cadena C. Caracterización de los polimorfismos Arg16Gly16 y Gln27Glu del β2-adrenoreceptor en adultos Colombianos y su asociación con el asma. [Tesis]
Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 2012
-NcoI. ThermoFisher. [Internet] Disponible en: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ER0571
Programa SPSS – Test de Chi-Cuadrado

Las diferencias numéricas

observadas, no son suficientes para
concluir que existe una asociación
entre la patogénesis del asma y el
polimorfismo Arg16Gly (A46G)

Para ello, realizamos una

prueba estadística que nos
permita concluir dicha
asociación
Programa SPSS – Test de Chi-Cuadrado

Se analiza el nivel de
significancia (alfa):
Alfa = 5% = 0,05
Programa SPSS – Test de Chi-Cuadrado
Conclusiones

Se determinó la frecuencia del polimorfismo Arg16Gly en el gen receptor adrenérgico beta2 en estudiantes de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de UNMSM siendo el 23% con presencia de homocigoto silvestre, el 46% de heterocigoto polimórfico y un 31% con presencia de
homocigoto polimórfico. Habiendo presencia de alelos A de 12 y alelos G 14 en la población estudiada ( 24 individuos 48 alelos , donde están
los otros).

Se estandarizó técnica PCR- RFLP para la determinación del polimorfismo Arg16Gly del receptor adrenérgico beta2 conforme a los
equipos disponibles en el laboratorio de Biología Molecular, (FFB_UNMSM) a una temperatura de denaturalización inicial de 95°C por 5
min, seguido de 35 ciclos de denaturalización a 95° C por 30 s, después 35 ciclos de anillamiento a 60°C por 30s,luego 35 ciclos de
extensión a 72° C y una extensión final da 72° C por 5 min.

Se determinó el polimórfismo Arg16Gly del gen receptor adrenérgico beta2 mediante PCR-RFLP, banda única de 146 pb para el
genotipo A/A, una banda única de 122 pb para el genotipo G/G y si es heterocigoto presenta bandas en los 2 tamaños.

La correlación de los perfiles PCR RFLP de los estudiantes con patogénesis de asma, usando la prueba chi cuadrado dio un valor crítico de 5.991
y un valor calculado de 0.9278 por lo cual no se puede rechazar la hipótesis nula (independencia de parámetros estudiados)
Recomendaciones

La principal dificultad en el proyecto de investigación fue el tamaño de la población estudiada por diversos
motivos éticos que refirieron los convocados. En sí no podemos descartar una falta de relación entre el
polimorfismo Arg16Gly por el tamaño de muestra pequeño (sesgo muestral)

Se sugiere emplear los kits respectivos con una mayor población, lo cual fue limitante debido a
escasos recursos económicos.

La información clínica es relevante para ampliar mayores relaciones con ciertas patologías
involucradas estrechamente con los receptores beta-adrenérgicos de tipo 2,: Sin embargo, los
voluntarios presentaron escasa información del estado de salud o control de tratamiento.

Se sugiere ampliar los parámetros a estudiar en una aplicación o consecución del presente proyecto y una
mejor eficiencia del tiempo, ya que son procesos sensibles para la obtención de resultados.
Aplicaciones del PCR-RFLP en el Perú

Todas las personas presentamos polimorfismos de nucléotido simple (SNPs) en

varios genes que expresan proteínas con funciones importantes. Una técnica
de acceso rápido en los laboratorios para detectar estos SNPs es PCR-RFLP.

La PCR-RFLP se puede utilizar para detectar SNPs en genes involucrados en enfermedades

metabólicas (diabetes tipo 2, sobrepeso, obesidad), neurológicas (Alzheimer, depresión, epilepsia)
asma, cáncer, entre otras. Así como para detectar SNPs en genes de proteínas blanco (factores de
transcripción, receptores, enzimas ,canales iónicos, transportadores, ADN, entre otros) donde
actúan diversas sustancias endógenas, nutrientes, fármacos o tóxicos.

Al reconocer la predispoción o la relación entre la variación genética

(polimorfismo) podemos brindar pronóstico o diagnóstico para la prevención
o tratamiento.

Soporte: Genetics
Aplicaciones de la asociación entre el
polimorfismo Arg16Gly y el Asma
Según el diario Gestión el Perú es el país latinoamericano con mayor incidencia de asma (uno de cada
tres niños peruanos sufre de asma). La mayoría de casos de asma se encuentran en la costa, Lima. El
clima húmedo y la contaminación ambiental de la capital hacen que los casos de asma aumenten como
la gran concentración de personas en estas zonas.

Los pacientes con asma no controlada debidamente, a largo plazo invierten el doble en
tratamiento que los pacientes que si controlan la enfermedad con un tratamiento adecuado. Es por
esto que el control del asma es de suma importancia ya que un paciente no controlado tiene altos
riesgos de hospitalización y visita médica y clínica.

Según los antecedentes del proyecto se establece en muchos casos su respuesta ineficaz o no
adecuada al tratamiento de broncodilatadores de las vías respiratorias, la fuerte predisposición de
padecer asma, y en algunos casos complicaciones a otros niveles de la función respiratoria por relación
adyacente.

Soporte: Diarioo Gestión Año, numéro

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Referencias bibliográficas
• Colocar nombres competes de los autores

• Martinez FD, Graves PE, Baldini M, Solomon S, Erickson R. Association between genetic polymorphisms of the β2-
adrenoceptor and response to albuterol in children with and without a history of wheezing. J Clin Invest
1997;100:3184- 3188.
• Paola Cadena C P. Caracterización de los polimorfismos Arg16Gly16 y Gln27Glu del β2-adrenoreceptor en adultos
Colombianos y su asociación con el asma. [Tesis] Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá. 2012
• Pablo Castro, et al. Polimorfismos de los receptores ß-adrenérgicos determinan el riesgo y etiología de la insuficiencia
cardíaca. BOLETIN DE LA ESCUELA DE MEDICINA. 30 (1). 2005: 10-16