Virologia

Ano Lectivo 2010/11

Técnicas Diagnóstico
Virologia – Parte I
 Testes imunológicos
 Baseiam-se em reacções antígeno-anticorpo:

 Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante

a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antígeno.

 Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de

induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2

 Anticorpo

 Cadeias de glicoproteícas :
 Cadeias leves
 Cadeias pesadas

 Região constante – local de activação

de outros elementos dos S. Imune;

 Região variável – local de ligação ao

antigénio

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 3

 Anticorpo

Tipos de anticorpos


Policlonais
Obtidos a partir de diferentes
clones de células;


Monoclonais
Obtidos a partir de um único
clone de plasmócitos

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 4

 Classes de anticorpos no Homem

Imunoglobulinas Características
IgG Principal Ig sérica
Envolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)
Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA Presente no soro, secreções e mucosas
Tem funções de opsonização.
IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como
receptor de antigénios.
Funções pouco definidas.
IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e
eosinófilos.
Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.

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 Antígeno

Epítopo

 Região do antígeno que reage com o anticorpo

 Possibilidade de reacções cruzadas

 Pequenas alterações na estrutura do antígeno,

entre outras factores, podem afetar
profundamente a ligação com o anticorpo

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 Aplicabilidade

 Papel importante:

Diagnóstico
Monitorização
Tratamento

 Tipo de amostra varia conforme o

que queremos pesquisar

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 7

 Técnicas de Imunologia

 Reacções Imunoenzimáticas
 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

 ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)

 Imunofluorescência

 Imunocromatografia

 ImunoHisto/Citoquímica

 Análise Proteínas: Western Blot

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 Reacções Imunoenzimáticas

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 9

 ELISA

Baseia-se numa reação imunoenzimática com detecção final por

espectrofotometria

 Permite determinar a concentração

do analito

 Calcular curva de calibração –

interpolar a concentração da
molécula a quantificar

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 10

 Tipos de ELISA

Sandwich

1. Poços revestidos com anticorpo especifico

2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 11

 Tipos de ELISA

Indireto
1. Poços revestidos com antígeno específico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectrofotometria

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 Tipos de ELISA

Competitivo
1. Ac específicos incubados com a amostra
Quanto
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag maior a
concentraçã
3. Ac secundário o de analito
4. Adição do substrato menor a
absorbância
5. Medição por espectrofotometria

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 ELISA

Método automatizado

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 ELFA

Reação imunoenzimática com detecção final por fluorescência.

 Permite fazer um análise quantitativa

 Curva de calibração

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 ELFA

 Teste, geralmente, automatizado onde é

necessário:

 Um cone sensibilizado com Ag,

serve, tanto de fase sólida como
sistema de pipetagem

 Uma barrete que contem os

reagentes necessários para a
realização da técnica

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 Imunofluorescência

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 Imunoflurescência

 Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos

 O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência

 A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência

 Fluorocromos mais usados

 Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)
 Rodamina

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 Imunoflurescência

 Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-

quantitativa

 Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

 Tipos de Imunoflourecênca

 Directa

 Indirecta

 Anti-complemento

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 Imunofluorescência Indireta

 Etapas

▫ Fixação (quando queremos

pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);

▫ Ac primário

▫ Ac Secundário (marcado com um

fluorocromo);

▫ Reagente de contraste

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 20

 Imunofluorescência anti-complemento
 Etapas

▫ Inactivação do complemento endógeno

▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo

▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado

▫ Ac conjugado que se liga ao complemento

▫ Detecção por microscopia de fluorescência

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 21

 Imunofluorescência
 Resultados

Permite localizar o
analito
EX: Membrana celular

Análise com o corante de

contraste

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 22

 Imunofluorescência
 Resultados

Pesquisa de anticorpos:
resultado positivo
(fluorescência verde)

Pesquisa de anticorpos:
resultado negativo

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 23

 Imunocromatografia

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 Imunocromatografia
 Teste qualitativo

 Detecção antigénios virais ou anticorpos

 Rápido e simples

 Fase móvel: amostra diluida

 Fase sólida: membrana revestida

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 25

 Imunocromatografia

 Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C

 Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex

 Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis

devido às partículas de látex

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 ImunoHisto/Citoquímica

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 27

 ImunoHisto/Citoquímica
 Imunologia e citologia ou histologia

 Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,

proteínas)

 Diferenças de expressão de proteínas

 Localização celular do antigénio

 Método qualitativo (maior parte dos casos)

 Quantificação relativa

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 ImunoHisto/Citoquímica
 Método directo
 Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente
com o antigénio

 Método Indirecto
 Ac primário que se liga ao antigénio
 Ac secundário marcado enzimaticamente

 Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)

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 ImunoHisto/Citoquímica
 Principio do método

PO+ H2O2+ Dador de electrões  PO+ H2O2+ precipitado

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 30

 ImunoHisto/Citoquímica
 Passos importantes
 Fixação (sol. Alcoólica)

 Permeabilizar (detergente)

 Ac primário

 Ac secundário conjugado

 Substrato com agente cromogénio

 Corante de contraste

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 31

 Imunohistoquímica

 Imunohistoquímica

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 32

 Imunocitoquímica

 Imunocitoquímica

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 33

 Análise Proteínas

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 34

 Western Blot

 SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 35

 Western Blot

 Blotting

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 Western Blot

 Detecção

1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção

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 Western Blot

 Aplicação

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 38

Virologia
Fonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-1&user_login=HugoSousa1

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