Valoración de la técnica Linear Array

HPV Genotyping Test (Roche)

En el diagnóstico y genotipado del
Virus del Papiloma Human
 Valoración de la técnica Linear Array HPV genotyping test (Roche) en el
diagnóstico y Genotipado del virus del Papiloma Humano.
Barranco R, Jaimez P, Viciana I, Mora L.
Servicio de Microbiología. Hospital Virgen de la Victoria. Málaga

Introducción: La presencia de Papilomavirus (HPV) está relacionada con más de un 99% de cáncer
cervical en todo el mundo. El HPV es un virus ADN bicatena rio pequeño sin envuel ta, con un genoma d e
unos 8000 nucleótidos. Existen más de 100 genotipos distintos, y unos 40 pueden infectar la mucosa
genital humana . Sólo un subconjunto de los genotipos virales de transmisi ón sexual está relacionado con
la displasia cervical de alto grado y el cáncer cervical. Se tra ta de genotipos calificados de alto riesgo,
mientras que los genotipos de bajo riesgo suelen relacionarse co n lesiones intraepi teliales de bajo grado
ó condilomas.

Objetivos: Valorar la técnica Linear Array HPV (Roche) para detecta r la presencia de papilomavirus y
su genotipos en diversas muestras clínicas enviadas a nuestro labora torio

Material y Métodos: Para el diagnóstico y genotipado de papilomavirus hemos utilizado el kit Linear
Array HPV Genotyping Test (Roche), en muestra s recibidas en escobillón seco, los cuales se introdujeron
a su llegada al laboratorio en líquido de conservación ThinPrep® y se mantuvieron a 4ºC hasta su uso. La
extracción del ADN la realiza mos en el si stema automa tizado MagnaPure(Roche) a partir de 2 mL del
líquido de conservación. El ácido nucleico extraído se amplificó mediante PCR con primers específicos de
HPV, que d etectan 37 genotipos distintos (incluidos 13 genotipos de al to riesgo) y el gen de la β -globina
humana, que controla la extracción y la amplificación. Los productos a mplificados se hibridaron en tira s
de nitrocelulosa con sondas oligonucleótidas y esta unión se detectó mediante determinación
colorimétrica en el sistema InnoLia de Innogenetics, que permi te identif icar genotipos de HPV
individuales, comparando visual mente el pa trón de líneas obtenidas con la guía de referencia de la tira d e
genotipado incluida en el kit.

Resultados: Hemos realizado estudio de papilomavirus a 114 mujeres y 92 hombres, con una media de
edad de 33 años (intervalo 14-82 años).

29 muestras presentaron infección por

múl tiples genotipos. Respecto al riesgo
oncogénico, en 58 muestras se aislaron
genotipos de bajo riesgo oncogénico (la
mayoría condilomas 82,8%), y en 34
muestras genotipos de al to riesgo
oncogénico: 16 eran muestras de
endocérvix, 14 condiloma s con múl tiples
genotipos, 2 exudados uretrales y 1
verruga vulgar.

Conclusiones: Linear Array HPV genotyping ki t es una técnica de fácil utilización que permi te la
detección y genotipado del virus del papiloma humano en distintos tipos de muestra con un al to
rendimiento, distinguiendo la presencia de genotipos tanto d e ba jo como de al to riesgo oncogénico.
La presencia de Papilomavirus
(HPV) está relacionada con más
de un 99% de cáncer cervical en
todo el mundo. El HPV es un
virus ADN bicatenario pequeño
sin envuelta, con un genoma de
unos 8000 nucleótidos. Existen
más de 100 genotipos distintos,
y unos 40 pueden infectar la
mucosa genital humana.
Sólo un subconjunto de los
genotipos virales de transmisión
sexual está relacionado con la
displasia cervical de alto grado y
el cáncer cervical. Se trata de
genotipos calificados de alto
riesgo, mientras que los
genotipos de bajo riesgo suelen
relacionarse con lesiones
intraepiteliales de bajo grado ó
condilomas.
 l

Todos los VPH se transmiten de piel a piel y la mayor parte de la gente

infectada desconoce que lo está.

Aunque sea la causa principal de los cánceres cervicales, en la mayoría de

las infecciones por VPH no se produce ninguna patología.

En un gran porcentaje de mujeres jóvenes la infección es temporal y tiene

poca importancia, a largo plazo el 70% de las infecciones desaparecen en
1 año y el 90% en 2.
Pero cuando la infección persiste entre el 15 y el 10 % pueden desarrollar
lesiones precancerosas en el cuello del útero que pueden progresar a
cáncer cervical.

Este proceso lleva entre 15 y 20 años, dando muchas oportunidades a la

detección y el tratamiento de las lesiones precancerosas, con alta tasa de
curación.

El médico alemán Harald Zur Hausen recibió el Premio Nóbel de

Medicina en 2008 por el descubrimiento del VPH como causa de cáncer
cervical.
Valorar la técnica Linear Array HPV (Roche)
para detectar la presencia de papilomavirus y
sus genotipos en diversas muestras clínicas
enviadas a nuestro laboratorio
 Para el diagnóstico y genotipado de papilomavirus

hemos utilizado el Kit Linear Array HPV Genotyping Test (Roche).

Se trata de una técnica cualitativa in vitro para detectar HPV

en muestras clínicas.

Utiliza la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena

de la polimerasa (PCR) y la hibridación del ácido nucleico.

Esta prueba se basa en cuatro procesos principales:

1- Recepción de la muestra

2- Extracción del ADN

3- Amplificación

4- Hibridación y detección.
Las muestras fueron recibidas en el laboratorio
en escobillón seco.

Se introdujeron, a su llegada a la sección, en

líquido de conservación ThinPrep y se
mantuvieron a 4ºC hasta su uso.
La extracción del ADN se realizó en el
sistema automatizado MagnaPure a partir
de 2 ml de liquido de conservación.
Las muestras son lisadas mediante
incubación con proteinasa K y un buffer
de lisis que contiene sales
caotrópicas.
Se añaden particulas magnéticas y los
ácidos nucleicos quedan atrapados en su
superficie.
Las sustancias no unidas son eliminadas en
varios pasos de lavado.
En el último paso del proceso
se obtiene la elución del ácido nucleico
purificado
El ácido nucleico extraído se amplificó mediante PCR con primers
específicos de HPV, que detectan 37 genotipos distintos (incluidos 13
genotipos de alto riesgo) y el gen de la β-globina humana, que
controla la extracción y la amplificación.

La PCR se basa en la amplificación, de una secuencia de ADN bicatenario

efectuada in vitro, por extensión repetida de los cebadores o “primers”
que se han situado en cada extremo de la secuencia que se quiere
amplificar, por acción de la polimerasa

Consiste en la repetición cíclica de tres reacciones que varian en la

temperatura de incubación: Desnaturalización 90º Fijación 50º y
Extensión 70º. Este proceso se realiza en el Light Cycler
Los productos amplificados se transfieren a los pocillos de la bandeja de
tipificación en los que se han colocado tiras de nitrocelulosa con sondas
oligonucleótidas de HPV. Este amplicón hibridará sólo con las sondas que
contengan la secuencia complementaria. La unión se detectó mediante
determinación colorimétrica en el sistema InnoLia de Innogenetics, que
permite identificar genotipos de HPV individuales,

comparando visualmente el
patrón de líneas obtenidas,
con la guía de referencia de la
tira de genotipado incluida en
el kit.
Hemos realizado estudio de papilomavirus a 114 mujeres y 92 hombres,
con una media de edad de 33 años (intervalo 14-82 años), procedentes de
su Centro de Salud (37,9%), Dermatología (37,9%), Ginecología (17%),
Servicio de Medicina Preventiva (2,9%), y Urología (3,4%).

Procedencia de las muestras

3,40%
Urología
3%
M.Preventiva
17% Ginecología

37,90% Dermatología
C.Salud
37,90%
 TIPOS DE MUESTRS
Las muestras a las que se les hizo la técnica de PCR-Hibridación
para el diagnóstico de HPV fueron: 9 verrugas vulgares, 84
condilomas, 86 exudados endocervicales, y 26 exudados uretrales.

Tipos de Muestras

Verruga vulgar
Ex. Uretral 3%
14%

Condiloma
41%

Ex. Endocervical
42%
 En 26 casos la muestra no amplificó; 88 fueron negativas, en 31
obtuvimos genotipo 6, en 12 genotipo 11, en 6 genotipo 16, en 4
genotipo 31 y en 10 otros genotipos. 29 muestras presentaron
infección por múltiples genotipos. Respecto al riesgo
oncogénico, en 58 muestras se aislaron genotipos de bajo riesgo
oncogénico (la mayoría condilomas 82,8%), y en 34 muestras
genotipos de alto riesgo oncogénico: 16 eran muestras de
endocérvix, 14 condilomas con múltiples genotipos, 2 exudados
uretrales y 1 verruga vulgar

PCR: Diferentes Genotipos

49,50%

No amplifica
Negativas
Genotipo 6
Genotipo 11
17,50%
15% Genotipo 16
Genotipo 31
7% Otros genotipos
5%
3% 2%
Linear Array HPV genotyping kit es una técnica de fácil utilización, que
permite la detección y genotipado del virus del papiloma humano en
distintos tipos de muestra con un alto rendimiento, distinguiendo la
presencia de genotipos tanto de bajo como de alto riesgo.
 Tipos de VPH (120 tipos)

Mucosos (anogenitales y
Cutáneos
aerodigestivos)

Alto riesgo
Bajo riesgo
16, 18, 31, 33, 35, 45,
6,11
56, 59, 66

Verrugas genitales. Displasia y cáncer cervical.

Displasias leves/bajo grado. Otros cánceres anogenitales
Papilomatosis respiratoria (pene, vagina, vulva, ano).
recurrente. Cánceres orales y esofágicos.
 LESIONES MAS FRECUENTES
Y SUS GENOTIPOS

Enfermedad Tipo VPH

Verruga común 2, 7

Verruga plantar 1, 2, 4

Verruga cutánea chata 3, 10

Verruga genital anal 6, 11, 42, 43, 44, 55

 riesgo muy alto28 : 16, 18, 31, 45

 otros de alto riesgo28 29 : 33, 35, 39, 51, 52, 56,
Malignidades genitales 58, 59
 probables de alto riesgo29 : 26, 53, 66, 68, 73, 82

Epidermodisplasia
más de 15 tipos
verruciforme
Hiperplasia focal epitelial
13, 32
(oral)
Papilomas orales 6, 7, 11, 16, 32
A continuación mostramos algunas imágenes
de infecciones por papilomavirus en distintas
zonas del
cuerpo
PAPILOMA CUTÁNEO
PAPILOMA BUCAL
ÓRGANOS GENITALES
Pene afectado de HPV
HPV EN LA MUJER
GRACIAS POR LA ATENCIÓN