Enzimología

(2)
Zoila F. Honorio Durand
2018
CINETICA ENZIMATICA (CONTINUACIÓN)
• RECORDAR:
• La ecuación de la cinética enzimática:

ETAPAS: 1 Y 2

Por lo que: las constantes cinéticas k, son propias de cada etapa, k1, k2 y k3, si lo expresamos como velocidad de cada
etapa sería:
• v1 = k1 [E] [S]
• v2 = k2 [ES]
• v3 = k3 [ES]
Observa cómo se presenta el enzima: Como E y como ES, por lo que la
concentración de
enzima total sería: [ET] = [E] + [ES]
Por lo que: [E] = [ET] - [ES]
• Reemplaza, ando en v1 = k1 [E] [S] se puede expresar como: v1= k1[S]
[ET] - k1 [S] [ES]
• Observa que v2 y v3 son iguales a [ES] con sus respectivas constantes
cinéticas k2 y k3, por lo que la:
v1 = v2 + v3
• Observemos en la ecuación cinética, k2 y k3 indican disociación del
complejo ES

• Reemplazando los valores de v1, v2 y v3, quedaría:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]
 Y despejando [ES], quedará:

• Considerando que la Constante de Michaelis-Menten (Km)

• La velocidad inicial, en estado estacionario, ( vo ), va estar directamente
relacionado con la formación del complejo ES y recordando el gráfico de v vs S, es
la Vmax.
• O sea se expresa como: Vo α [ES] y que Vmax α [ES]
• Debemos tener en cuenta que en cualquier reacción enzimática [Et], k3 y Km son
constantes.
Recordemos la ECUACION DE MICHAELES-MENTEN

Que expresado en gráfico es:

• Si bien todos los enzimas responden a la cinética de Michaelis-
Menten, representada con una curva hiperbólica, sin embargo
hay cinética no Michaeliana, producidas por enzimas alostéricos,
cuya gráfica es una curva sigmoidea
• ¿CÓMO EXPRESAMOS LA CINETICA ENZIMÁTICA?
• ¿CÓMO OBTENEMOS Y ANALIZAMOS LOS DATOS CINÉTICOS?
Unidades de expresión de la actividad catalítica
UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMATICA: Es la cantidad de enzima que cataliza la transformación
de 1 micromol de substrato por minuto (1 µmol/min), bajo condiciones estándar, Se ha sugerido 30Â °C y que el
pH y concentración del sustrato sea óptimo para la actividad del enzima

KATAL (Kat): Es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mol de sustrato por segundo.
1 Kat = 6 x 107 Unidades Internacionales de Actividad Enzimática

ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Es el número de unidades de enzima por mg de proteína.

Es una unidad usada más en preparaciones enzimáticas.

ACTIVIDAD MOLECULAR (Número de recambio): Es Número de moléculas de sustrato, transformadas , por

minuto, por una molécula de enzima.
Se calcula dividiendo la velocidad máxima del enzima por peso molecular; es una característica de las enzimas
individuales y no refleja la pureza de la preparación.
 Otras expresiones de la actividad catalítica
La Unidad Anson: Se usa cuando el sustrato es la hemoglobina: 1 Unidad Anson = Cantidad de enzima que, bajo
condiciones del test, libera 1 mmol (1mmol= 10-3 mol) de AA positivos al reactivo de FOLIN por min, calculados
como tirosina. La miliUnidadAnson= 1 µmol (10-6 mol) de tirosina.

NOTA: El Rvo de Folin-Ciocalteu para fenoles con contiene Tungstato y Molibdato de Sodio, Sulfato de
Litio, HCl, H3PO4 y Bromo: Da color violeta con los aminoácidos fenólicos.

Si la enzima contiene grupos prostético, una coenzima o un Centro catalítico, cuya concentración sea
medible.
La Actividad Enzimática puede expresarse también por el número de moléculas de substrato, transformadas
por minuto, por cada centro catalítico.
RECORDEMOS QUE:
• Que los enzimas tienen una estructura proteica
• Que para su acción requieren de cofactores y/o coenzimas
• Que la acción enzimática se realiza en un medio acuoso, por lo que
sus estructuras están en estado nativo según temperatura, presión,
pH del medio.
• Cualquier alteración del medio puede afectar la actividad cinética
enzimática… por lo que repasemos
 PREGUNTAS

1.- QUÉ INDICA EL VALOR DE Km?

V/2

2.- La cinética enzimática de dos enzimas: hexocinasa (negro) y

glucocinasa (rojo) frente al mismo sustrato: glucosa

Glucosa + ATP------Enz-------- Glucosa 6 P + ADP Km

OBSERVA LA GRAFICA

a.- Que diferencia hay entre el Km de color negro y el Km de color rojo?

b.- Con cuál de los enzimas se obtiene más rápido la transformación del sustrato?.

AHORA PENSEMOS QUE DURANTE LA ACCION ENZIMÁTICA SE PUEDEN PRESENTAR OTRAS

SUSTANCIAS NO DESEABLES A LAS QUE SE LES CONOCE COMO INHIBIDORES
CLASIFICACION SEGÚN SU ACCION
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA CINETICA ENZIMATICA DE: (a); (b) y (c )

Vmax

Km
MEDIDA DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA: VELOCIDAD

V= + dP/dT PREGUNTA:
V= - dS/dT
Cuáles son los factores que pueden
alterar esta cinética enzimática?
 Representación recíproca doble
(Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
0.02

1 Km 1 1
-1/Km   
0.01
v Vmx s Vmx

0.00
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s
 RECIPROCA DE LA EC. DE M.M: REPRESENTACION
1/Vo vs 1/S
(a) (b) (c )

Km: aumenta Km: Igual Km:

Vmax; Vmax: Vmax:
DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA
ECUACION LINEAL

Se tiene:
vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S]
Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = Km * 1 + [S]
vo Vmax [S] Vmax[S]

Se simplifica:
1= Km * 1 + 1
vo Vmax [S] Vmax

La ecuación de la recta es:

y=a*x+b
La ecuación de la recta es:
y=a*x+b
donde:
y = 1 y x = 1
Vo [S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la

gráfica de Lineweaver-Burk o del doble
reciproco usando la pendiente y la
intersección negativa de x.
EJEMPLOS

DROGA USO ENZIMA TIPO DE

TERAPEUTICO AFECTADA INHIBICION
Lovastina Hipercolestero HMGCoA Competitiva
lemia reductasa
5fluoroacil cancer Dihidrofolato competitiva
reductasa
captopril hipertensión ECA competitiva
 EJEMPLO de No Competitivo

• El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a

otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no
competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para
su actividad.
 Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales (El CN- en el Fe de Citocromo

Oxidasa)

4. Metales pesados
 Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3
E+I EI EI* E’ + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un

inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I

en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
EJEMPLO

- Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,

sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por

producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió-
ticos b-lactámicos.

n ANTIBIÓTICOS

MO
MO

Sintetizan B-lactamasa
 - SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL

Los estados depresivos, en general, están relacionados con un

descenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos
(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos

neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como

terapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos
inhibidores suicidas de la MAO
AMPLIAR CON:
Inhibidores enzimáticos
Practica sobre inhibición con el
NaF