FCFB-QUIMICA FARMACEUTICA – 2014

TECNICAS DE
SEPARACION

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LOURDES VINO NINA
 Filtración
Decantación
Evaporación
Cristalización
Sublimación
Destilación
Extracción
Cromatografía

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LOURDES VINO NINA
 Sin embargo, antes se deben tratar la
muestra y se procede a diferentes
tecnicas de EXTRACCION DE ANALITOS

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LOURDES VINO NINA
 SEPARACION DE ANALITOS

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 5
LOURDES VINO NINA
 6
LOURDES VINO NINA
 7
LOURDES VINO NINA
CROMATOGRAFIA

El botánico ruso Mikhail Tswett 1903,

observacion de la separacion de extracto
vegetal.
Padre de la Cromatografía.
Khun Lederer 1931, separacion CL de
carotenoides.
Ismailov y Scraiber, utilizaron láminas de
vidrio para colocar capas muy delgadas de
alúmina y luego aplicaron extractos
vegetales, dando así la primera forma de
Cromatografía de Capa Fina.
Egon Stahl (1956) dió el nombre de
Cromatografía de Capa Fina. Estandarizó
los procedimientos, equipos y adsorbentes
dando un auge a la técnica simple, a bajo
costo y eficiente.

La cromatografía es un proceso físico-químico de separación 8

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LOURDES VINO NINA
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

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LOURDES VINO NINA
TIPO DE FASE MOVIL

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LOURDES VINO NINA
- Separa mezclas de compuestos mediante la exposición
de dicha mezcla a un sistema equilibrado.

- Dependen de la distribución de los componentes de la

mezcla entre dos fases inmiscibles: fase móvil
(ACTIVA), fase estacionaria.

FM líquido o un gas
FE sólido o un líquido.

Combinaciones de FM Y FE …….., distintos tipos de

técnicas cromatográficas.
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 14
LOURDES VINO NINA
 2. CROMATOGRAFIA PLANA: PAPEL, CAPA FINA

Dos tipos de fuerzas opuestas: La que arrastra y otras que retardan.

Las fuerzas propulsoras, actúan apartando las sustancias del punto de

origen y desplasandolas en dirección del flujo de origen: ….flujo de
disolvente y la solubilidad de cada sustancia.

Las fuerzas retardantes, tratan de impedir el movimiento de las sustancias,

llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel. Son dos
principales la adsorción y el reparto.

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LOURDES VINO NINA
 En el papel, por ejemplo: con 6 a 12 % de agua (el papel)
mas el disolvente (circulando), entra la función de reparto

El grado de reparto, una vez conseguido el

equilibrio, se llama coeficiente de reparto
o razon de distribución.

Por ejemplo, si por una columna con alúmina como absorbente se introduce una disolución
conteniendo nitratos de Fe (III), Cu (II) y Co (II) y posteriormente se pasa agua ligeramente acidulada
con ácido nítrico se observa la separación de tres zonas diferenciadas (de arriba abajo) pardo- rojiza de
Fe (III), azul de Cu (II) y rosa de Co (II). Si se desean apreciar mejor las distintas bandas se puede
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introducir una solución de ferrocianuro potásico como revelador. Se observan entonces coloraciones
más intensas; azul oscuro de Fe4 [Fe (CN)6]3, pardo- rojiza de Cu2 [Fe (CN) 6] y verdosa de Co2 [Fe
(CN) 6].
LOURDES VINO NINA
 El soporte-fase estacionaria para TLC

Adsorbentes
 Tamaño de Partícula
-Tamaño de las partículas del adsorbente,  Volúmen de Poro
cuanto más finamente dividido esté mayor será  Diámetro de Poro
su adhesión al soporte, aunque también se le
 Área Superficial
puede añadir un adherente (yeso,...)
 Homogeneidad
 Pureza
Algunos de los adsorventes más utilizados son:
Celulosa
Almidón
Azucares
Gel de sílice (silicagel)
Óxido de aluminio (alúmina)
Carbón activo (carbón en polvo)
Kieselguhr

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LOURDES VINO NINA
Adsorbentes
El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente
ácido, su pH oscila entre 4-5.

El tamaño del grano (particula) suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño

de poro varía de 20 a 150Å.

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LOURDES VINO NINA
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante:
yeso (sulfato de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al
adsorbente.

También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por
separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.

Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar
los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides,
ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina
cromatografía de fase reversa (silanizado). 19
LOURDES VINO NINA
Adsorbentes

La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico

debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la
bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a la
alúmina, dándole a ésta un carácter básico. No consigue un desarrollo tan
alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.

La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas

ácidas, básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que retendrá
con mayor avidez a los componentes polares.

Preparación de placas.
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LOURDES VINO NINA
 APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Se aplica en la placa según el objetivo:

Analítico ó Preparativa en:

• Banda
• Punto ó Mancha

- .
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LOURDES VINO NINA
 Elección del eluyente

Dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del

material en que la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden
creciente de polaridad: En la elección del eluyente influyen
Eter de petróleo. varios factores:
Eter dietílico. •Precio.
Ciclohexano. •Pureza.
Acetato de etilo. •No utilizar mezclas de eluyentes
Tetracloruro de carbono.* (reproducibilidad).
Piridina. •No utilizar compuestos muy volátiles.
Benceno.* •Evitar que contengan trazas de
Etanol. metales (catalizadores).
Cloroformo.*
Metanol. La elección del eluyente se realiza de
Diclorometano. forma empírica. Se estudia la polaridad
Agua. del componente y probar con eluyentes
Ácido acético. cada vez menos polares.
*compuestos cancerígenos. 22
LOURDES VINO NINA
 CORRIDA - desarrollo

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LOURDES VINO NINA
 Descendente
CORRIDA
Ascendente
Simple
Circular
Horizontal
Desarrollo

Común
Múltiple Bidimensional
Continuo

a - distancia recorrida por

Rf 
a el analito.
b b
a b - distancia recorrida por
x el frente
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LOURDES VINO NINA
CORRIDA

Cualitativa

x M x M x M

Identificación Pureza Ausencia

Cuantitativa Preparativa

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x x x x
LOURDES VINO NINA
 REVELADO
Localización de sustancias

Es visible, por que muestra coloración como los pigmentos. Si la muestra

(mancha) no es coloreada se requiere de métodos que nos permitan visualizar
el(los) componente(s) presentes. También se conoce este procedimiento como
Revelado.

Métodos físicos. (ópticos).

Generalmente se utiliza radiación UV
.

Métodos químicos. Químicos (por

inmersión o rociado). Se obtienen
derivados coloreados o fluorescentes
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LOURDES VINO NINA
 Métodos químicos

Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo

revelador y los componentes separados.
Ejemplos:
yodo, forma complejos coloreados con los
componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón),
las manchas desaparecen con el tiempo, con lo que
debe señalar las manchas aparecidas.

Acido sulfúrico, reacciona con los componentes

orgánicos (oxida) se ven manchas negras. El tamaño
de las manchas no está relacionado con la cantidad de
componente separado.

Además de estos reveladores generales, existen otros

específicos:

- 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

- Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
- Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
- Ninhidrina (para aminoácidos
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LOURDES VINO NINA
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 29
LOURDES VINO NINA
 Métodos físicos

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LOURDES VINO NINA
Destructivo H2SO4
I2
No Destructivo Lámpara
ultravioleta

H2SO4
Generales
Lámpara ultravioleta

I2
Selectivo
Ftalato de anilina (azúcares)

Ninhidrina (Amino-ácidos)
Específico Resorcina (Cetosas) 31
LOURDES VINO NINA Difenilamina + U.V. 254 (Clorados)
Consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente F254 ó F366. Al
colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de
la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que
hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto
donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo

que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta

Detector Fuente de luz

Placa
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cromatográfica
LOURDES VINO NINA
• Para la deteccion se usan detectores, que convierte una
propiedad física no medible en una señal elaborable y ofrece
información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad
física.

• Detectores:
• Sensibilidad.
• Linealidad.
• Donde hay dos límites en la curva de linealidad:
• El límite de concentración inferior,(LD)
• El límite Superior
• Rango Dinámico Lineal.
• Ruido.
• Límite de Detección.
• Corriente de Fondo.

El registro individual es el cromatograma. 33

LOURDES VINO NINA
Constantes Rf Y Rx
 Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)
 Determinación indirecta (raspado y valoración)
 Determinación directa (Densitómetro).

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LOURDES VINO NINA
Análisis Cualitativo
• Medida de Rf
• Comparación Visual de Color/Intensidad
• Propiedades UV/IR/MS/NMR

Análisis Cuantitativo
• Semi-cuantitativo
• Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha contra
una serie de manchas patrones de concentración conocida
• Cuantitativo
• Indirecta
• Directa
• Densitometría
• Medida de Transmisión. Medida de luz transmitida a través de la substancia.
• Medida de Emisión. Medida de luz reflejada desde la substancia
• Espectrofotometría
• Fluorescencia
• Fluorescencia con "quenching"
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LOURDES VINO NINA
 Cromatografía en columna

Fase móvil

Fase estacionaria
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 38
LOURDES VINO NINA
 Principales mecanismos de interacción
en cromatografía líquida:

 Adsorción superficial
 Partición
 Intercambio iónico
 Exclusión molecular
 Afinidad

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LOURDES VINO NINA
La fase estacionaria es
sólida. La separación se
logra por las diferencias en
solubilidad (en fase móvil) y
de retención por adsorción
(en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos.

Es un fenómeno
superficial,
aumentado con
la formación de
puentes de
hidrógeno. 40
LOURDES VINO NINA
 Sílica (90%) y alúmina (10%) son las fases estacionarias
más comunes.

Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son

atraídas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria.

Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase

estacionaria y así se logrará su migración diferencial.

Se usan mezclas de disolventes para conseguir el

poder de elución y la selectividad adecuadas.
Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a
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otro más activo (acetona, cloruro de metilo, etc.).
LOURDES VINO NINA
 Reparto
Distribución de los solutos
entre una fase móvil líquida y
otra estacionaria inmiscible,
soportada sobre un sólido
inerte. La discriminación se
produce por diferencias de
solubilidad.

El soluto se equilibra
entre el líquido de la fase
estacionaria y la fase
móvil, por diferencia de
solubilidad. Hasta llegar
a un equilibrio 42
LOURDES VINO NINA
 El mecanismo de actuación es similar al de un modelo de extracción en
contracorriente.
 Las especies más retenidas serán las que presenten mayor afinidad
(solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase móvil (eluyente).
 La separación de los solutos se basa en las diferencias en esta solubilidad
relativa.
Existen dos modos básicos de operación:
Fase normal (FN). Se trabaja con FE polar y FM no polar.
Fase reversa (FI). Se emplea una FE no polar y FM polar.

LOURDES VINO NINA 43

Reparto,

la fase
estacionaria
es un líquido
sobre un
soporte

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LOURDES VINO NINA
Según empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el
orden de elución de bandas y el tiempo de análisis.

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LOURDES VINO NINA
Ejemplo de FE por ejemplo para HPLC.

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 47
LOURDES VINO NINA
Exclusión molecular

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 49
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 50
LOURDES VINO NINA
 Tierras de Diatomea
Exclusión molecular:
Sephadex (geles)

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LOURDES VINO NINA
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

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LOURDES VINO NINA
Cromatografia de intercambio ionico

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 54
LOURDES VINO NINA
LOURDES VINO NINA 55
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

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 57
LOURDES VINO NINA
RESINAS PARA C. DE INTERCAMBIO IONICO

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 59
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 60
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 61
LOURDES VINO NINA
 Separación de proteínas. La carga de la matriz de la columna,
así como la carga de las proteínas de-penderán del pH del
solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la
concentración de iones).

 Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga

iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el
punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la
matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a
las proteínas en la columna.

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LOURDES VINO NINA
Cromatografía de afinidad

Afinidad, separación por medio de receptores63

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LOURDES VINO NINA
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

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 66
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•Elución es el desplazamiento de un soluto de la fase
estacionaria por un disolvente.

Elución isocrática: composición constante del eluyente.

Elución en gradiente: cambio continuo de la
composición del eluyente (F.M) en sentido de aumento de
la fuerza eluyente

* Cuanto más semejante es el disolvente en polaridad respecto a

la fase estacionaria, mejor eluye a los solutos

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 69
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 70
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 71
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RESOLUCION

SEPARACION: 72
PERFECTA BASTANTE BUENA NO BUENA
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Cromatografía liquida en columna a baja presión

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