Determinación simultánea de cafeína y vitamina B6 en bebidas energéticas mediante HPLC
TANIUSHKA E. DÍAZ MELÉNDEZ
DANIEL TORRES COLÓN CHEM 430-L Objetivos
Determinar la concentración de cafeína y
vitamina B6 en bebidas energéticas para deportistas. Técnicas utilizadas
Los estudiantes universitarios desarrollaron un
método para determinar la concentración de cafeína y vitamina B6 en Red Bull y otras bebidas energéticas utilizando HPLC. Aparatos y Materiales
Los cromatogramas los recogieron usando un
sistema de HPLC Shimadzu LC-10At equipado con un detector de matriz de diodos SPD-M10A y una columna de Pumomenex C18 de 5m de 250 x 6.40 nm. EL puerto de inyección estaba equipado con una inyección de 20 microlitros. Reactivos
El Red Bull lo desgasificaron por agitación manual
durante 5 min. El hidrocloruro de piridoxina (vitamina B6)(Sigma Aldrich), la cafeína (Eastman Co), el agua de grado HPLC de fosfato dibásico(Mallinckrodt) anhidro de sodio (Fisher Scientific) y el metanol de calidad HPLC (Mallinckrodt) los usaron tal como los recibieron. Soluciones de fase móvil
El HPLC lo eluyeron con una solución isocrática
de tampón de fosfato 60:40 (v/v) (50 mM, pH 3.0) y metanol a un caudal de 1.0 mL/min. En el HPLC cargaron un depósito con tampón de fosfato acuoso y otro con metanol de grado HPLC, y usaron la bomba de HPLC para crear la mezcla de isocrato. Un tercer depósito contenía agua de grado HPLC; eso lo utilizaron junto a metanol para el lavado de la columna. Soluciones de fase móvil
Prepararon el tampón de fosfato disolviendo
3.525g de Na2HPO4 en 400 mL de agua de grado HPLC en un vaso de precipitados pre-registrado. Una vez disuelto, ajustaron el pH a 3.0 mediante la adicción de ácido clorhídrico concentrado. Transfirieron la solución a un matraz volumétrico de 500 mL y lo diluyeron a volumen con agua de calidad HPLC. Solución estándar combinada La prepararon disolviendo 0.0506g de clorhidrato de piridoxina (vitamina B6) y 0.1253g de cafeína en suficiente solución de tampón de fosfato /metanol 60:40 para alcanzar un volumen de 100.00 mL. Obtuvieron una solución madre con 506 ppm de vitamina B6 y 1253 ppm de cafeína. Preparación de la muestra Realizaron las muestras añadiendo 10.00 mL de Red Bull a cada uno de los cinco matraces aforados de 100.00 mL. Añadieron alícuotas de la solución madre a cada matraz (0.00 mL, 1.00 mL, 2.00 mL, 3.00 mL y 4.00 mL) y llevaron los matraces a volumen con la solución de tampón de fosfato 60:40/metanol. Procedimiento de prueba de HPLC Extrajeron una muestra de 100 microlitros y la inyectaron en el bucle de 20 microlitros para garantizar el llenado completo. La fase móvil consistió en una mezcla de tampón de fosfato/metanol 60:40 a una velocidad de 1 mL/min. Cada ciclo fue seguido por lavados de 90:10 agua/metanol y 90:10 metanol/agua para asegurar una columana limpia para la próxima muestra. Método de análisis HPLC y condiciones de lavado de columna Start End Eluent Purpose Time/min Time/min 0 12 Isrocratic 60:40 Analytic run phosphate buffer/methanol 12 13 Linear ramp to 90:10 Column wash water/methanol
13 16 Flush with 90:10 Column wash
water/methanol 16 17 Linear ramp to 90:10 Column wash methanol/water
17 20 Flush with 90:10 Column wash
methanol/water 20 21 Linear ramp to 60:40 Column wash phosphate buffer/methanol 21 25 Return to isocratic Reset for analytic run 60:40 phosphate buffer/methanol Resultados y Discusión
La vitamina B6 y la cafeína aparecieron en el
cromatograma en aproximadamente 3 y 10 minutos, respectivamente, y ambos ingredientes tenían una absorción lo suficientemente alta a 292 nm para hacer curvas de concentración razonables. Los estudiantes pudieron ver claramente la cantidad de solución estándar añadida. Las concentraciones de cafeína y vitamina B6 se determinaron mediante el método de adicción de estándar. Resultados y Discusión
En el Red Bull, las concentraciones de cafeína y
vitamina B6 fueron de 27.2 y 4.22 ppm, respectivamente, que corresponden a 68.1 y 10.6mg en una lata de 8.3oz. El método también se lo aplicaron a las bebidas energéticas Monster y Rockstar con idénticos tiempos de retención de cafeína y vitamina B6. Cromatograma
Cromatograma que muestra los picos de
vitamina B6 y la cafeína. Curva de adición
Curva de adición de estándar muestra la
ecuación de intersección y la extrapolación a la intersección x.