Validación Métodos Analíticos

Cuantitativos, Cualitativos y
Semicuantitativos en el Lab. Clínico

Rigoberto Marcelo Yáñez Vera

Julio 2012
 Norma NCh2547.Of2008
(ISO 15189)

• 5.5 Procedimientos Analíticos.

• 5.5.2 El laboratorio debe usar sólo
procedimientos validados.

VALIDAR VERIFICAR
 Validación
“Confirmación mediante el examen y
la obtención de evidencias
objetivas que aseguran el
cumplimiento de una serie de
requerimientos particularmente
definidos para aplicaciones
concretas”
(ISO 8402-1994 o NCh2000 – ISO 8402).
 VALIDACIÓN DE MÉTODOS
CUANTITATIVOS

Parámetros de calidad (desempeño analítico):

- LINEALIDAD
- EXACTITUD:
-PRECISIÓN: *Repetibilidad
*Reproducibilidad
-VERACIDAD, Trazabilidad
- INCERTIDUMBRE
-SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS
- SENSIBILIDAD
- LÍMITE DE DETECCIÓN
- LÍMITE CUANTIFICACIÓN
- ROBUSTEZ
Respuesta del instrumento ANÁLISIS CUANTITATIVO

LL

LC
LD
Intervalo LL = L. de linealidad
lineal LC = L. de Cuantificación
LD = L. de Detección

Concentración
 ANÁLISIS CUANTITATIVO

-LINEALIDAD
Capacidad del método analítico de obtener
resultados linealmente proporcionales entre la
concentración del analito y su respuesta.
Análisis estadístico:
*Curva regresión y = a + b x
*Coeficiente de determinación r2
*Análisis de varianza (regresión) con
Si p>0,05 es
significativo y por Estimación falta de ajuste
ende los datos Error residual puro.
tienden a ser lineales.
 ETAPAS DE LA REGRESIÓN

1 Selección del modelo: Normalmente una línea recta

y=a +bx
(donde a es la pendiente de la recta y b la ordenada al origen)

2 Establecimiento del diseño experimental:

 dominio experimental: rango de concentraciones
 distribución de las medidas
 número de medidas

3 Estimación de los parámetros del modelo. Regresión

por mínimos cuadrados.

4 Validación del modelo: ANOVA

 Linealidad: Curva de Calibración IgG
INMUNONEFELOMETRÍA

Concentración (mg/dL) Medición 1 Medición 2

X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544

Medición instrumental (señal): intensidad de la luz dispersada

por los complejos antígenos-anticuerpos.
 CURVA CALIBRACION IgG

1200

1000

800
LECTURA

600

400

200

0
0 2 4 6 8 10 12

CONCENTRACION mg/dL
 CURVA CALIBRACION IgG

INMUNONEFELOMETRÍA
3.4
3.2
3
log lectura

2.8
2.6
2.4
2.2
2
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
log conc.
 Exactitud

Grado de concordancia entre el resultado

de una medición y el valor de referencia
aceptado o verdadero.

* Nota: El término “exactitud” cuando se aplica a un

conjunto de resultados de mediciones implica la
combinación de los componentes aleatorios y de un
error sistemático común o de un componente de sesgo
(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)
 Exactitud
(Norma ISO 3534-1)

-Precisión: grado de concordancia entre

resultados de mediciones obtenidas
independientes bajo condiciones establecidas
(repetibilidad y reproducibilidad).
-Veracidad: grado de concordancia entre el valor
medio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.

Exactitud = Precisión + Veracidad

 Precisión

La precisión depende sólo de la distribución de errores

aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor
verdadero o el valor especificado.
-Repetibilidad
-Precisión intermedia o reproducibilidad
intralaboratorio
-Reproducibilidad

(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)

 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

PRECISIÓN:
Grado de concordancia entre resultados de
mediciones obtenidas de una serie repetida de
análisis, sobre una muestra homogénea, bajo
condiciones establecidas (Norma ISO 3534).

REPETIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de un método
efectuado en las mismas condiciones, sobre el
mismo analito, con el mismo método, con el
mismo operador, utilizando el mismo instrumento
de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA
PRECISIÓN

Media
Desviación estándar
Coeficiente de variación
Análisis de varianza F (comparación de la
desviación estándar)

Estudio homogeneidad muestra:

Análisis de varianza (F)
Prueba de “t”de Student.
 REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA LA
DETERMINACIÓN IgG
(Homogeneidad Muestra)

Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %

“t” calculado = 0.0713 < “t” tabla 5;0.025 = 2.571

No existe diferencia estadística significativa y por lo tanto las
muestras son iguales y homogéneas.
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

PRECISIÓN

REPRODUCIBILIDAD:
Es la medida de la precisión de los resultados de
un método analítico efectuado sobre el mismo
analito, pero en condiciones diferentes (diferentes
equipos utilizados, el operador, el período de
tiempo, etc.)
 REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG

IgG mg/dL

DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3

1556 1568 1564

1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568
 REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG

n 18 (en tres dìas diferentes)

media 1557.72 Si F < P no existe
DE 12.27 diferencia
estadística
CV 0.8 % significativa en
las mediciones
Precisión 99.2 % de los grupos.

Análisis de Varianza
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC gl CM F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 17
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

VERACIDAD:
Grado de concordancia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y el valor
de referencia aceptado (certificado). Norma ISO
3534
Análisis estadístico
Media experimental
Desviación estándar experimental
Prueba de “t” de Student
 VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG

MRC DB Lote 084705

IgG mg/dL
n = 10 931,8
942,3
951.8
924,8
Media experimental 930.9
918,6
Media certificada 925.0
927.1
920,5
938,4
935,2
918,8
 VERACIDAD INMUNONEFELOMETRIA
PARA DETERMINACIÓN DE IgG

Valor exp. MRC

media 930,9 925
s (DE) 11,0545

“t” calculado = 1,6963 <“t” (tabla) 9;0.025 = 2,262

p = 0,124

Χ  μ   n
t 
n - 1, α/2 s
Se acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
 Incertidumbre

Magnitud asociada con el resultado de

medición que caracteriza la dispersión de los
valores que razonablemente podrían ser
asignados al mesurando.
 Incertidumbre
-Incertidumbre estándar:
Incertidumbre de un resultado de medición expresada
como desviación estándar.
-Incertidumbre estándar combinada:
Incertidumbre estándar como resultado de una
estimación mediante la propagación de errores con
base en las incertidumbres individuales.
-Incertidumbre expandida
Incertidumbre estándar que se expresa como un
intervalo de confianza.
CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE EXPANDIDA

s
Ux    t α/2; n - 1 
n
gl = n - 1 (grado libertad)
nivel  = 0,05

U MRC IgG exp. = ± 7,9 mg/dL

 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD

Capacidad del método analítico para medir en

forma exacta un analito particular dentro de una
mezcla compleja, sin interferencia de otras
sustancias o analitos.

Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando pero afecta al

resultado de la medición (interferencia).
 Interferencia de la Señal

Algunos compuestos presentes en la muestra

por un artefacto aumentan o disminuyen la
magnitud del mecanismo de detección.

Ejemplos:
Fluoresceína, EDTA , Azida de Sodio, Lípidos,
Complemento, Fibrinógeno, Albúmina
 Detección y Control de Interferencias

• Son difíciles de detectar pues se desconoce el

resultado verdadero. Se obtienen de los datos del
fabricante o de literatura. El laboratorio debe establecer
requisitos de ausencia de interferencia para valores
definidos de las magnitudes.

• Verificar resultados de pacientes con condiciones

clínicas asociadas con interferencias (enfermedades
hepáticas, fallas renales, embarazo, incongruencias con
cuadro clínico).

• Inspeccionar las muestras visualmente buscando

hemólisis, ictericia, lipemia o evaluarlas usando
indicadores séricos.
 ESTUDIO DE INTERFERENCIAS

1 Prueba de dilución lineal (las interferencias no se

comportan linealmente con la dilución).

2 Analizar la muestra por otro método (comparación de

métodos).

3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir

sustancias potencialmente interferentes.

4 Análisis de muestras enriquecidas con el interferente.

Respuesta del instrumento ANÁLISIS CUANTITATIVO

LL

LC
LD
Intervalo LL = L. de linealidad
lineal LC = L. de Cuantificación
LD = L. de Detección

Concentración
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

SENSIBILIDAD
Es la capacidad de un método analítico de
registrar ligeras variaciones de la concentración.

b
γ   Sensibilidad
b = Pendiente obtenida desde la regresión lineal.

sm Sm = desviación estándar de la muestra.

 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

LÍMITE DE DETECCIÓN (LD)

Menor concentración o cantidad de analito

detectable con razonable certeza por un
procedimiento analítico dado. Concentración que
proporciona una señal en el instrumento
significativamente diferente de una muestra blanco.

Ybl = señal promedio del blanco.

y  3 * s bl
LD 
bl Sbl = desviación estándar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.
b
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)

Es la menor concentración de analito que puede

determinarse con precisión y exactitud razonables
en las condiciones establecidas y se expresa en
unidades de concentración.

Ybl = señal promedio del blanco.

ybl  10 * s bl Sbl = desviación estándar del blanco.
LC  b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.
b
 ANÁLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIÓN

ROBUSTEZ:

Grado de concordancia de los resultados al

efectuar cambios en las condiciones operativas
y ambientales normalizadas del método.
 ROBUSTEZ
Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeñas pero deliberadas
variaciones en los parámetros del método y provee
información de su comportamiento en la rutina.

 Parámetros estudiar:
- Efectos del congelado-descongelado
- Tiempos de incubación
- Cambio pH tampones
- Temperaturas de incubación
- Longevidad de los reactivos
- Preparación de la muestra
- Conservación de la muestra.
NORMA NCh 2446.Of1999– Guía para la
validación de métodos de ensayo – Principios y conceptos
generales

5 Procedimiento de validación
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de
acreditación deben contar con procedimientos y directrices
para planificar y controlar el proceso de validación de
métodos de ensayo. Sin embargo, la discusión anterior ha
indicado claramente que no puede desarrollarse un
procedimiento único. En consecuencia, tiene que
desarrollarse una gama de diferentes alternativas de técnicas
de validación. Cuán detallada deba ser la validación, depende
de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).
 DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patología Molecular

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA

OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, al
menos las siguientes características metrológicas:
1.-Error sistemático (sesgo). El fabricante del calibrador deberá
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados.
Sin embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que el
proceso proporciona resultados satisfactorios.

2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberá

proporcionar la información de las interferencias.
 DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de
Bioq. Clín. y Patología Molecular

SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA

OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Límite de detección. El fabricante deberá propocionar
especificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección.
El Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuando
observa diferencia.
5.-Contaminación
6.-Verificar dilución
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;

CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office
Laboratory Accreditation)

Recomendación de validación de métodos de acuerdo

a la complejidad de la prueba o determinación:

-Pruebas de mínima complejidad (waived tests). No

hay recomendación para la validación de método.
Seguir directrices del fabricante.
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;

CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office
Laboratory Accreditation)

-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados

por el FDA los estudios de validación de métodos deberian seguir las
siguientes recomendaciones:
-Verificar los parámetros de calidad o especificaciones de desempeño
(demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante):
-Exactitud
-Precisión
-Rango de los resultados analíticos reportado por el método
-Verificar que los intervalos de referencia del fabricante son
apropiados para la población de pacientes del laboratorio.
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos

(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;

CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office
Laboratory Accreditation)

-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados

por el FDA
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparación de métodos para estimar la inexactitud o
sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
-Hacer estudio de linealidad para estimar el
rango de la determinación reportado por el fabricante
-Obtener valores de referencia para verificar intervalo de
referencia indicado por el fabricante
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office
Laboratory Accreditation)

-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o

desarrollados en el laboratorio, la validación de los métodos requiere:
-Exactitud
-Precisión
-Sensibilidad analítica
-Especificidad analítica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
-Rango de los resultados analíticos reportado por el método
-Intervalo de referencia (valores normales)
-Cualquier otro parámetro requerido para el desempeño del método
 Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulación Validación de Métodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office
Laboratory Accreditation)

-Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o

desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisión
-Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
-Límite de detección para estimar interferencias permanentes
-Experimentos de recuperación para estimar proporción de
interferencias
-Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
 Métodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos

• En los laboratorios de análisis se generan

cada vez más mediciones que dan
respuesta rápidas de tipo cualitativo.
• Respuesta de tipo binario: Si / No .
• Presencia o ausencia de determinado analito.
• Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito.

• Se denominan sistemas de “screening”.

 Sistemas de Screening

• Muchas veces se utilizan como una etapa previa

para luego realizar un análisis cuantitativo y
confirmatorio.
• Evita análisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
• A nivel microbiológico generalmente en
identificación bacteriana son diagnósticos y no
presuntivos.
 Análisis Cualitativo

Método Confirmatorio

Sistema de Análisis
tamizaje cuantitativo
SI
(screening)
Presencia del analito

> 2 ng/mL Ausencia del analito

< 2 ng/mL
•Menor experimentación.
NO
•Decisión rápida.
•De fácil manejo, portátiles, etc.
•Sin necesidad de equipos.
•Ahorro.
No se
analiza
 Sistemas de Medida Cualitativos

 Análisis cualitativo clásico o sensorial:

 Color: cambio, aparición.
 Olor.
 Turbidez.
 ELISA.
 Crecimiento bacteriano.
 Detección instrumental:
 UV: fluorescencia, potenciometría.
 Sensores: químicos, bioquímicos, etc.
 ELISA.
 Análisis Cualitativo Clásico o
Sensorial
• La respuesta binaria SI / NO se obtiene
directamente.
• En general la presencia del analito se
determina por comparación con un blanco.
• Pruebas baterías bioquímicas

• Se encuentran también las pruebas de

Kits.
• Son dispositivos comerciales para pruebas concretas.
• Contienen todos los reactivos necesarios.
• Pueden contener algún instrumento sencillo.
 Análisis Cualitativo Clásico o
Sensorial

• Pruebas de kits:
• Látex para serotipificar Streptococcus.
• Tiras de orina.
• Pruebas rápidas para meningitis bacterianas.
• API.
• Método de CIM por microdilución en microplacas.
• Coaglutinación.
• Método ELISA rápido para detección C. difficile
 Análisis Cualitativo Sensorial

• La determinación se hace mediante una

medida instrumental:
• Colorimetría.
• Fluorescencia.

• La presencia o no de un determinado analito

puede ser el nivel límite de detección o a un
nivel superior.
 Análisis Cualitativo Sensorial

• La respuesta instrumental que se obtiene se

transforma en respuesta binaria SI/NO e implica
un tratamiento de datos.
• Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
• Valor de absorbancia para la concentración
correspondiente.
• Si el valor es superior la respuesta es Si.
• Ej. Métodos automatizados para Hemocultivos.
• Ej. Métodos automatizados para CIM.
• Ej. Estandarización automatizada a 0,5 MF.
 Método de ELISA

• Método Semicuantitativo.
• Se basan en una reacción inmunológica.
• La detección puede ser sensorial o
instrumental.
• Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .
• Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampión, etc.
• Ej. Parásitos: Chagas
• Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.
 Validación Métodos Cualitativos

• Métodos cualitativos también deben validarse.

• Validar consiste en verificar y documentar su
validez a requisitos específicos.
• La validación implica como etapa previa la definición
de los requisitos analíticos o de calidad.
• Luego entonces la determinación de estos
requisitos.
• Los resultados se expresan diferente a los métodos
cuantitativos.
 Expresión de Resultados

 Métodos Cualitativos
Análisis Cualitativo / screening

SI / NO
Con probabilidad
de error
 También tiene dos valores el primero binario y el
segundo es la probabilidad de error asociada a la
decisión tomada.
 Se expresan en términos probabilísticos.
 Requisitos de Calidad
Método Cuantitativo
 Linealidad.
- Homogeneidad.
 Precisión:
- Repetibilidad.
- Reproducibilidad.
- Robustez.
 Veracidad (exactitud).
 Incertidumbre.
 Limite de detección.
 Límite de cuantificación.
 Rango de cuantificación
 Selectividad e Interferentes.
Método Cualitativo
 Especificidad.
 Sensibilidad.
 Valor predictivo positivo (VPP).
 Valor predictivo negativo (VPN).
 Exactitud diagnóstica.
 Límite de corte (cut-off).
 Incertidumbre o región de error.
 Límite de detección.
 Robustez.
 Especificidad

• Se define como la capacidad o habilidad del

sistema de detectar en forma exacta un analito
en una matriz.
• Proporción de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
• Generalmente se expresa como probabilidad.
 Especificidad (E)

Analito Analito
presente ausente

Método Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos (FP)

Método Falsos Verdaderos

negativo negativos (FN) negativos (VN)

Proporción de muestras sin el analito, cuyo método es

negativo:
E = VN / (VN + FP)
 Sensibilidad

• Es la capacidad o habilidad del sistema de

detectar muestras positivas cuando realmente lo
son.
• Proporción de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
• Generalmente se expresa como probabilidad.
• Concentración de un analito necesaria para
producir una unidad de cambio de lectura
instrumental.
 Sensibilidad (S)

Analito Analito
presente ausente

Método Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos (FP)

Método Falsos Verdaderos

negativo negativos (FN) negativos (VN)

Proporción de muestras que contiene el analito cuyo

método es positivo:
S = VP / (VP+FN).
 Falsos Negativos (FN)
• Desviación negativa.
• El método a validar da un resultado negativo y el
método de referencia da positivo.
• Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, dé como negativa por el método.
• Corresponden a muestras que contienen uno o más
analitos por encima del valor límite permitido y que en
prueba de screening dan respuesta negativa.
• Se concluye con este resultado previo que la muestra
no contiene el analito en los niveles fijados cuando si
lo contiene.
 Falsos Positivos (FP)

• Desviación positiva.
• Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, dé como positiva por el método.
• Corresponden a aquellas muestras que realmente no
contienen el analito en el nivel definido y que por Ej. la
prueba de screening lo detecta.
• Se produce cuando el método a validar proporciona
un resultado positivo sin confirmación y el método de
referencia da un resultado negativo.
 Exactitud Diagnóstica

• Proporción de resultados correctos

(verdaderos positivos + verdaderos negativos).
• Capacidad para detectar correctamente los
positivos y los negativos.
• Es el grado de concordancia entre el resultado
obtenido en un ensayo y el valor de referencia
que debiera obtenerse.
 Exactitud Diagnóstica (ED)

Analito Analito
presente ausente

Método Verdaderos Falsos

positivo positivos (VP) positivos(FP)

Método Falsos Verdaderos

negativo negativos(FN) negativos (VN)

Proporción de resultados correctos :

ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
 Criterio de Exactitud Diagnóstica

El mejor criterio actual para establecer la

presencia o ausencia de la condición
(enfermedad), evento o característica de
interés usando un método simple o una
combinación de métodos de laboratorios que
incluyan, pruebas de imagen, patológicos,
información clínica, ensayos o paneles de
referencia.
 Límite de Corte o Cut-off

• Limite de cuantificación??
• Número mínimo de microorganismos dentro de una
variabilidad definida que pueden determinarse bajo
las condiciones experimentales del método
evaluado.
• Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos.
• Relacionado a la sensibilidad, corresponde al nivel
de concentración donde la sensibilidad es un 95% y
la probabilidad de error tipo β es de un 5%.
 Límite de Corte (cut-off)

Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

Resultados métodos
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
• Valor del Límite de Corte (cut-off). Valor de corte del método,
dado principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados
positivos y bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una
dicotomía (presencia/ausencia, si/no, etc.).

C= 2ng/mL
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
• Región de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisión del
método, es un rango donde encontramos error Tipo I o α (Falsos
positivos) y Tipo II o β (falsos negativos) del método.

α C= 2ng/mL β
 Definiciones de Requisitos de
Calidad
• Región de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2):
• C50: Concentración del analito donde se produce un 50% de
resultados positivos y un 50% de resultados negativos.
• Intervalo C5 – C95: Rango de concentraciones requeridas del analito
donde a concentraciones < de C5, son resultados concretamente
negativos y > C95 son concretos positivos.

Verdaderamente Negativas. C50 Verdaderamente Positivas.

 Límite de Detección

• Cantidad mínima de analito que puede ser

detectado en una muestra pero que no puede
ser estimado con precisión o sea que no
necesariamente es cuantificado en las
condiciones del ensayo.
• Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos.
• Los resultados se expresan como detectado / no
detectado.
 Robustez

 Efecto Matriz:
 Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones
en los parámetros del método y provee información
de su comportamiento en la rutina.
 Identificar variables que pueden tener efectos
significativos en la respuesta del método.
 Analizar cada set en condiciones experimentadas
dadas y determinar el efecto de cada cambio.
 Efectos congelado/descongelado, tiempos y
temperaturas de incubación, cambios pH, preparación
y conservación de la muestra y reactivos.
 Resumen: Definiciones Requisitos
de Calidad
• Especificidad. Proporción de muestras negativas (no reactivas)
que son correctamente identificadas.
• Sensibilidad. Proporción de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
• Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, dé positiva por el método.
• Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, dé negativa por el método.
• Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba
resulta reactivo.
• Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra
de ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.
• Exactitud diagnóstica analítica. Capacidad del método para
detectar correctamente los positivos y los negativos.
 Observaciones
• Hay pruebas en las que tiene un impacto a nivel
de Salud Pública además de individual al dar un
resultado Falso (+) o Falso (-)
• Ej. VIH, HEP. B
• En resistencia antibiótica es de mayor impacto
los falsos negativos, o sea informar como
sensible cuando es resistente.
• De mayor trascendencia también en Falsos (-):
• Hemocultivos, meningitis, resistencia antibiótica,
VIH, etc.
 Método ideal

‘Normal’ Enfermo
Nr de individuos

No falsos positivos o negativos

Valores método
 Realidad Métodos

Normal, sin el analito Enfermo, con el analito

Nr de individuos

+2SD

Valores
Falsos Falsos Método
Negativos Positivos
 Definiciones del ejemplo

Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

Verdaderos Positivos

Sin enfermedad
Resultados métodos
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes “negativos” Patientes “positivos”

Resultados método Falsos

Sin enfermedad Positivos
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

Verdaderos
negativos

Resultados métodos
Sin enfermedad
Con enfermedad
 Definiciones del ejemplo

Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”

Falsos
negativos

Resultados método
Sin enfermedad
Con enfermedad
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
• Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos
categorías, (+)/(-) según el método, y establecen una tabla de
comparación respecto del resultado obtenido mediante el
criterio de exactitud diagnóstica analítica.
Criterio de exactitud diagnóstica

Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total

POSITIVOS VP FP VP + FP

NEGATIVOS FN VN FN + VN

Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN

*CLSI: EP12-A2
 Tablas de Contingencia

• Las mas simples son las que diferencian las

muestras en dos categorías : positivo o
negativo.
• Luego se establece una tabla de comparación
respecto al resultado obtenido con resultado de
método de referencia .
• A partir de la tabla se calculan los cuatro
parámetros básicos, además de otros: falsos(+),
falsos(-), sensibilidad y especificidad.
 Tablas de Contingencia
Ventajas:
o Son de fácil aplicación en la mayoría de los
bioensayos.
Desventajas:
o Dan una medida global de la capacidad del método.
o Se estima que la muestra se comportará
estadísticamente de forma similar a las ya analizadas.
o No se calcula una probabilidad de error en cada
muestra en particular.
o La capacidad de la tabla depende del número de
muestras analizadas.
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
• Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero
(positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale
decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B.

P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b)

P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b)

P(a): prob. de obtener un resultado positivo

P(b): prob. de obtener un resultado negativo
P(p/a): prob. de obtener un resultado (+)
cuando esta presente la enfermedad.
P(p/b): prob. de obtener un resultado (+)
cuando no esta presente la enfermedad.
 Evaluador de los requisitos de
Calidad
• Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de
Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones
en la sensibilidad y especificidad que son resultantes de la
modificación que se haga en los niveles de corte, de acuerdo al
proceso de decisión clínica para un analito determinado.

* A. Pulido, I. Ruisánchez, R.
Boqué , F.X. Rius
 Sensibilidad vs. Especificidad.

(Fracción verdaderos positivos)

100
(Fracción verdaderos positivos)

100
80

SENSIBILIDAD
80
SENSIBILIDAD

60
60
40
40
20
20
0
0 0 20 40 60 80 100
0 20 40 60 80 100
ESPECIFICIDAD (Fracción verdaderos 1-ESPECIFICIDAD (Fracción falsos
negativos) positivos, FFP)

Sensibilidad vs. 1- Especificidad.

 Lectura de las Curvas ROC

* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICO
-Identificación
-Titulo
-Protocolo redactado por
-Protocolo aprobado por
-Objetivo -Alcance
-Factores críticos
-Selección y tratamiento muestra y MRC
-Identificación equipo: certificado calibración
-Método analítico:
-Variables a determinar : análisis estadístico
-Personal que desarrollará la validación
-Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño
-Conclusiones
-Registros
-Referencias
 INFORME DE VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO ANALÍTICO

-Identificación
-Titulo
-Informe redactado por
-Informe aprobado por
-Objetivo -alcance
-Responsabilidad
-Equipo, materiales, documentos
-Procedimiento
-Cálculos y análisis estadísticos
-Criterio de aceptación vs Resultados
-Informe de desviaciones
-Informe resultados y conclusiones
de validación del método
Cuándo Verificar y cuándo Validar???

VALIDAR VERIFICAR