Hibridación in situ

Fundamentos y aplicaciones
CONCEPTO
La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en
el sitio físico en el que se encuentra, permitiendo analizar su distribución en
cromosomas, células y tejidos.

FUNDAMENTO
Se basa en la complementariedad de las bases que componen los ácidos
nucleicos: G con C (ADN y ARN) y A con T (ADN), o U (ARN).
Se diseña una sonda marcada que hibride con la secuencia a detectar.
Este sistema permite estudiar la distribución in situ de una determinada
secuencia de interés:

Las que revelan la presencia de algún patógeno

Asociadas a enfermedades de origen genético

Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores

o las que se emplean como indicadores de alteraciones
numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo
Tipos de sondas

- ADNcd
- ADNcs
- ARN
- Oligonucleótidos sintéticos

Marcaje de las sondas

- radioactivo: uso de radioisótopos (revelado por ARG)

H3 P32 P33
S35

- no radioactivo: marcaje directo e indirecto mediante haptenos (detección

inmunológica)

Digoxigenina ALP
Peroxidasa
Biotina FITC
 Pasos para la hibridación in situ

a) Generación de ácidos nucleicos marcados para una detección subsecuente.

b) Fijación de tejidos (seccionados), preparación de cromosomas.

c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido nucleico

marcado.

d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.

e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.

f) Detección de la sonda marcada, revelando la localización celular de los

ácidos nucleicos.
Aplicaciones de la hibridación in situ
1) Expresión génica
Expresión del gen Nkx2.1, esencial para
el desarrollo de los pulmones, la
glándula tiroidea y los ganglios basales
telencefálicos.

2) Infecciones virales

Diagnóstico de HPV Diagnóstico de EBV Diagnóstico de CMV

 3) Diagnóstico
Gen HER2: produce una proteína
homónima, cuya alteración puede
ocasionar cáncer.
Durante el desarrollo del cáncer
HER2 no amplificado
este gen se amplifica provocando
la sobreexpresión de la proteína.
La amplificación del gen HER2 se
asocia a tumores de mama muy
activos y con una tasa de
supervivencia muy baja.

HER2 amplificado
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
 CITOGENÉTICA MOLECULAR
Análisis de reordenamientos cromosómicos complejos y su identificación
inequívoca.
Identificación de genes particulares sobre el cromosoma

Objetivo
Detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos en cromosomas, células en
interfase y secciones de tejidos morfológicamente preservados

Fundamento
• Característica física del ADN de desnaturalización-renaturalización en respuestas
a cambios de temperatura
• Capacidad de renaturalizarse con una molécula foránea pero homóloga a su
secuencia (hibridación)
• Característica dinámica del ADN que no afecta la morfología cromosómica
PROTOCOLO
DESNATURALIZACIÓN DE LA SONDA DESNATURALIZACIÓN DEL ADN BLANCO
• Mezclar con Sn de Hibridación • Sn de Formamida 70% a 72ºC
• Calentar a 85ºC •Deshidratar en alcoholes: 70-90-100%

HIBRIDACIÓN
• Cámara húmeda a 37ºC

REVELADO-OBSERVACIÓN
SONDAS

Fragmentos de ADN (300-500 pb)

homólogos a la secuencia blanco,
marcados con una molécula
detectable directamente o mediante
una reacción inmunoquímica

Estos fragmentos deben cubrir una región de por

lo menos 100 kb para poder ser detectados al
microscopio
DIRECTAS:
La sonda está marcada con un fluorocromo

INDIRECTAS:
La sonda está marcada con una molécula detectable mediante una reacción
antígeno-anticuerpo, donde el anticuerpo está unido al fluorocromo
Según la extensión de la región a detectar se dividen en:

Contienen secuencias
complementarias de las secuencias
repetidas que se encuentran en los
centrómeros y telómeros de los
cromosomas.

Colecciones de sondas
Se hibridan a una región particular de un gen. Estas de un tamaño reducido,
sondas son útiles cuando se ha aislado una cada una de las cuales se
pequeña parte de un gen y se quiere averiguar en hibrida a una secuencia
qué cromosoma se encuentra. diferente a lo largo de
todo un cromosoma.
Sondas gen-específicas

Ej: Inactivación del cromosoma X en

sexo femenino.
Centro de inactivación (Xic) ligado al X.
Incluye el locus de inactivación XIST
(sobreexpresión en X inactivo;
represión en el X activo).
 Sonda de fusión
A)

NORMAL
NORMAL TRANSLOCADO
TRANSLOCADO

B)

Punto de
NORMAL
NORMAL TRANSLOCADO
TRANSLOCADO ruptura
Punto de
Sonda de separación ruptura
Sondas región-específicas
 Sondas de pintado cromosómico

Permite detectar alteraciones estructurales o numéricas (metafase).

Inconvenientes:
- No permite detectar inversiones paracentroméricas
- Baja resolución, lo que impide detectar pequeñas deleciones, translocaciones y
duplicaciones.
 APLICACIONES CLÍNICAS DE FISH
FISH en la detección de leucemias
t(9;22)(q34;q11) origina el cromosoma Filadelfia

Leucemia mieloide crónica (95%) + algunos casos de

leucemia linfocítica aguda.

Gen de fusión BCR / ABL tiene importancia diagnóstica.

Región BCR (22q11.2)

Región ABL (9q34)

t(8;21) : Gen de fusión AML1 / ETO

t(8;21)(q22;q22): Leucemias mieloides agudas,

especialmente de tipo M2.

Indica pronóstico bueno.

FISH en interfase mostrando
alteraciones numéricas
FISH en espermatozoides

Sondas centroméricas para los

cromosomas X, Y, y 18.
Sondas locus-específicas para los
cromosomas 13 y 21.
Porcentaje de espermatozoides
cromosómicamente alterados
permitiendo enumerar la cantidad de
cromosomas/espermatozoide.

Indicaciones:
- Oligoastenoteratozoospermia
- Abortos recurrentes
- Baja tasa de fecundación y fallo de
la implantación.
 Cariotipo espectral
(FISH multicolor)

Se genera un cariotipo en el que cada

cromosoma es pintado de un color.

La imagen es procesada digitalmente

asignando un color distinto a cada
cromosoma.

Cromosoma normal: color uniforme

Cromosoma con rearreglo: varios colores.

Detecta translocaciones, grandes

deleciones y duplicaciones.

Desventaja: no permite detección de

duplicaciones y deleciones de pequeños
fragmentos.
 Hibridación Genómica Comparativa (CGH)

• Técnica relacionada con FISH

• Permite analizar el número de
cromosomas totales
• Control positivo: células adultas
normales
• Resultados analizados por un software

NORMAL igual cantidad de rojo y verde =

amarillo

TRISOMIA > rojo (ADN muestra analizada)

MONOSOMIA > verde (ADN control)

CGH en cáncer
ADN ADN
tumoral normal
ganancia material genético
pérdida material genético