Producción de Glucoamilasa por

Aspergillus niger

Katherine L. Suárez Herencia

 Introducción
• El desarrollo de tecnologías emergentes implica el reto permanente de
utilizar nuevas herramientas de gestión tecnológica. La ingeniería de
enzimas y su respectiva tecnología en el contexto de la biotecnología, es
una de las áreas del conocimiento sobre las cuales reiterativamente se
plantean grandes expectativas como posible generador de ventaja
competitiva en economías emergentes. En este sentido, la importancia de
producir glucoamilasa a partir de Aspergillus sp. mediante aplicaciones
biotecnológicas está dirigida esencialmente al área de alimentos.
 Enzimas
• Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de las
diferentes reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de los
seres vivos. Para que se produzca una determinada reacción, es necesaria
la presencia de una determinada enzima, y la mayor o menor cantidad de
ésta suele modificar la velocidad de la reacción controlada.
 Amilasas
• Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones hidrolíticas del
almidón, dando origen a diversos productos que posees una gran
relevancia para algunas operaciones y procesos industriales. Las amilasas
son comúnmente halladas en animales y plantas; sin embargo, para fines
industriales las más utilizadas son aquellas de origen bacteriano o fúngico.
 Tipos de alfa-amilasas
• Amilasa de origen fúngico. Se producen por fermentación de una cepa del hongo
Aspergillus niger, y es la más utilizada en la fabricación del pan, como alternativa a
la harina de malta. Ello es debido al hecho, entre otros, de que la alfa-amilasa
fúngica tiene una mayor tolerancia a la sobredosificación que la de origen cereal,
lo que se basa en su desactivación durante la primera fase de la cocción (60-65°C),
por lo que no existe el riesgo de que se produzca exceso de dextrinas, lo cual
produciría migas pegajosas.
La actividad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dos
unidades:
– FAU (Unidad Fungal Amilasa o Fungal Amylase Unit), que es la cantidad que
dextrinizará una solución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 40°C.
– SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución de almidón
puro, a un pH de 4,5, durante 60 minutos a 30°C.
La relación entre las FAU y las SKB, es que 1.000 FAU/g aproximadamente
equivalen a 10.000 SKB/g.
Las amilasas de origen fúngico utilizadas en la panadería tienen una actividad
variada que va desde baja actividad 2.500 SKB/g hasta alta actividad 50.000 SKB/g.
 Tipos de alfa-amilasas
• La alfa-amilasa Bacteriana. Se produce a partir de la bacteria
Bacillus subtilis, y es muy resistente al calor por lo que a
temperaturas de 70 a 90°C alcanza su máxima velocidad de
reacción. El efecto secundario típico de la amilasa bacteriana es una
disminución de la viscosidad del engrudo del almidón.

• La alfa-amilasa de origen cereal (harina de malta). Su elaboración

consiste en la germinación del trigo para que se movilicen las alfa-
amilasas naturales del grano. Estas amilasas se inactivan a 75°C.

• La Amiloglucosidasa. También denominada Glucoamilasa se

obtiene del hongo Aspergillus niger, y actúa sobre las dextrinas
produciendo glucosa, lo que se traduce en una aceleración de la
fermentación.
 Glucoamilasa
• La glucoamilasa es un enzima extracelular producida por diversas especies de
Aspergillus.

• La Glucoamilasa también reconocida como amiloglucosidasa es una exohidrolasa que

en la nomenclatura internacional está identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre
sistemático es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa. Es una enzima que tiene como
función actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos operando en
los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa separando unidades de glucosa a partir del extremo no
reductor de la cadena.

• Los enlaces ramificados α-1-4 también se hidrolizan, pero mucho más lentamente,
formándose un jarabe de glucosa, un contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y
de un 30 a un 5 % de oligosacáridos grandes. Debido a esto se le define como una
enzima desramificadora. La enzima es capaz de hidrolizar también, aunque
lentamente, los enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza
para obtener glucosa pura sólida.
 Glucoamilasa
• El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón
es glucosa, lo que la diferencia claramente de las alfa y beta amilasas.

• Las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es

máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65°C. La rata de
reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la
molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente
sometidos a licuefacción.

• La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la industria de procesado del

almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4,5 y con períodos de
incubación de 48-92 horas, para transformar las dextrinas formadas por la
a-amilasa en glucosa.

• La Glucoamilasa se encuentra en el mercado tanto en forma sólida como

líquida (líquido color marrón claro).
 Usos de la Glucoamilasa
• Fabricación de alcohol (biocombustibles).
• Fabricación de azúcar de almidón.
• Elaboración de la cerveza y fabricación de vinagre (la levadura de la
substitución con la enzima puede mejorar la producción).
• Fabricación de jarabes de glucosa.
• Fabricación de polvos gastrónomos, de antibióticos, de ácido cítrico, etc.
• Fabricación de jugos de fruta (hidroliza el almidón, evitando que se
produzca turbidez después de la concentración).
• Como reactivo para la determinación de almidones en alimentos.
 Aspergillus niger
• En 1729 el Aspergillus fue catalogado por primera vez por el biólogo
italiano Pier Antonio Micheli, que usó el nombre "Aspergillum" por
parecerse el hongo al instrumento usado para dispersar agua bendita.
 Aspergillus niger
• Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en
vegetales -muy común en la lechuga, el tomate o la acelga-. Es una
de las especies más corrientes del género Aspergillus. Puede existir
en dos formas básicas: levaduras e hifas.
• El Aspergillus niger se cultiva para producir varios productos
químicos como: ácido cítrico (E330), ácido glucónico (E574), y
enzimas como: glucoamilasa, galactosidasa, etc.
 Clasificación Científica
Dominio: Eukaryota
Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
Subfilo: Pezizomycotina
Clase: Eurotiomycetes
Orden: Eurotiales
Familia: Trichocomaceae
Género: Aspergillus
Especie: Aspergillus niger
 Producción y Caracterización de Amiloglucosidasa
extracelular de Aspergillus niger CA-19 mediante
Fermentación en Estado Sólido (SSF)

• Este estudio fue realizado con el propósito de producir la enzima

amiloglucosidasa a partir de A. niger usando el método de Fermentación
en Estado Sólido (SSF - Solid-State Fermentation) y encontrar una
caracterización preliminar de la enzima producida.

• A. niger fue aislado en un medio de agar almidón con azul brillante de

Remazol y fue usado como sustrato del proceso de fermentación para la
producción enzimática el salvado de arroz suplementado con harina de
soya.

• El crudo de la enzima extraída tuvo una temperatura y pH óptimos a 60°C

y pH 4 respectivamente. Con excepción del almidón de cocoñame, la
preparación enzimática fue capaz de hidrolizar el almidón del maíz y el
almidón de otras raíces como el camote, yuca, etc. La hidrólisis fue
directamente proporcional a la cantidad de almidón de la fuente.
 Detección y Aislamiento de la cepa amilolítica de
Aspergillus niger
• La cepa amilolítica de A. niger fue aislada de muestras de suelos tomadas
en diferentes áreas de la UNAAB (University of Agriculture Abeokua,
Nigeria) usando un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol.
La producción de una amilasa fue detectada por la desaparición del color
azul del medio alrededor de los lugares de inoculación de las colonias, que
fue calculada restando al radio de la zona aclarada el radio de la colonia.
• Las colonias de A. niger que produjeron grandes zonas de aclaramiento
fueron tomadas y purificadas sembrándolas en estrías en un agar de
extracto de malta. La identificación de este aislamiento se basó en las
características morfológicas de las colonias y de las células con referentes
en el método de Rasper y Fennel (1965).
 Producción de Amiloglucosidasa por Fermentación en
Estado Sólido
• La fermentación fue realizada en matraces Erlenmeyer de 250ml. El
medio estaba constituido de salvado de arroz (10g) y harina de soya
(3g) humedecido al 55%, esta humedad fue dada con una solución
acuosa de sales minerales [MgSO4.7H20, 0.1%: KH2PO4, 0.1%; CaCl2,
0.1%; FeSO4, 0.05% y (NH4)2SO4, 0.1%]. La esterilización se hizo a
121°C durante 15 minutos. Después de enfriar los matraces, fueron
inoculados con 1ml de suspensión conidial de A. niger CA-19 (2x106
esporas/100ml) y fue incubado a 30°C durante 72h.

• La extracción de la enzima del salvado enmohecido se hizo: Para 1g

de salvado enmohecido, fueron agregados 10ml de buffer citrato
0.01M (pH4.5) y la mezcla fue removida en un agitador orbital (LAB-
LINE, UK) a 150 rpm, durante 1 h a 28°C. El filtrado fue realizado a
partir del caldo obtenido de la fermentación.
 Prueba de Amiloglucosidasa

• La actividad de la Amiloglucosidasa fue probada a

60°C durante 1h usando almidón de maíz al 1%
(p/v) en buffer citrato 0.1M (pH4.5). Los azúcares
reductores fueron calculados por el método del
DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico).

• Una unidad de actividad de amilasa (FAU) fue

definida como la cantidad de enzima que liberó
0.1 umol de D-glucosa de almidón en 1.0uL de la
mezcla reactiva.
 Caracterización de Glucoamilasa
• Efecto de la Temperatura: Para establecer la temperatura óptima
de actividad de la amiloglucosidasa, la enzima fue incubada con
almidón soluble en un buffer de acetato 0.1M, en donde las
temperaturas de reacción fluctuaron entre 20 y 90°C.

• Efecto del pH: La actividad de la amiloglucosidasa fue medida en

varios rangos de pH que fueron de 4 a 10. El pH de reacción de la
mezcla fue variando conforme se usaban diferentes buffers (buffer
citrato para pH=3-6, buffer fosfato para pH=7-8 y buffer borato
para pH=9-10)

• Estabilidad de la Enzima: La solución enzimática se mantuvo a una

temperatura ambiente por 34 días. A diferentes intervalos de
tiempo, se tomaron alícuotas de solución estándar de amilasa para
analizar su actividad.
 Caracterización de Glucoamilasa
• Digestión de Almidones Primarios: La capacidad del crudo de la
enzima para hidrolizar almidones primarios fue estudiado usando
almidones de maíz, yuca, camote, ñame y cocoñame. La solución
comercial de almidón fue utilizada como estándar. La solución
enzimática (1mL; buffer acetato fosfato (pH 4.5, 1 mL)) y 3mL de
cada solución de crudo de almidón fue incubada a 60°C durante 1h.
La capacidad de los crudos de almidón para hidrolizarse fue
calculada de acuerdo a la cantidad de azúcares reductores (mg g-1)
producidos.

• Cromatografía en Capa Fina: Los azúcares producidos por la

hidrólisis del crudo de almidón con amiloglucosidasa de A. niger CA-
19 fueron identificados mediante Cromatografía en Capa Fina (TLC)
usando como fase móvil n-butanol : ácido acético : dietil éter : agua
(9:6:3:1). Los azúcares reductores fueron revelados con un spray de
hidrocloruro de p-anisidina.
 Discusión y Resultados
• Es necesario el aislamiento y la selección de los organismos adecuados
para la producción de amilasa.

• El resultado de este estudio mostró que la capacidad de aislar

microorganismos productores de amiloglucosidasa, como el Aspergillus
niger, constituyen la mayor fuente de producción de tipo comercial para
enzimas usando la técnica de Fermentación en Estado Sólido.

• En la Fermentación en Estado Sólido, la selección de un adecuado sustrato

sólido es un punto crítico que involucra la detección de un gran número
de materiales agro-industriales para el crecimiento microbiano y la
formación de sus productos. Dado que el salvado de arroz es un producto
barato y de fácil disponibilidad, su uso como sustrato para la producción
de enzimas lo hace ideal para la producción a gran escala de amilasa por
fermentación en estado sólido.
 Caracterización de Glucoamilasa

• Los estudios preliminares para caracterizar la enzima por sus actividades

enzimáticas mostraron que la amiloglucosidasa producida por Aspergillus
niger CA-19 fue óptimamente activa a 60°C. La actividad de la enzima
decayó drásticamente a temperaturas mayores a 60°C y se paralizó
totalmente a los 90°C.
 Caracterización de Glucoamilasa

• El resultado mostró que la actividad de la enzima fue óptima cuando el

ensayo se llevó a un pH 4.0. Al superar el pH 4, se observó un continuo
decaimiento en la actividad de la enzima.
 Hidrólisis del Almidón Crudo

• La capacidad de los gránulos de almidón de ser digeridos por la enzima,

depende de la fuente de almidón y de la cantidad de enzima con la que se
traten.
 Cromatografía en Capa Fina
• Los productos finales determinados mediante la cromatografía en capa
fina en óptimas condiciones (pH 4.0 a 60°C) mostraron que la glucosa fue
el único producto obtenido después de 10, 20, 40 y 60 minutos de
hidrólisis, indicando que el patrón de comportamiento de la enzima fue
completamente el de la amiloglucosidasa. Este comportamiento resulta
en una gran ventaja para la producción industrial de jarabe de glucosa. Así
es como, este estudio de producción de amiloglucosidasa por A. niger CA-
19 nos arroja resultados bastante promisorios.
 Conclusiones
• Este estudio confirmó que Aspergillus niger es un excelente productor
extracelular de amiloglucosidasa. Dado el hecho de que este
microorganismo se encuentra en la lista de microorganismos
generalmente reconocidos como seguros (GRAS - Generally Recognized As
Safe) para elaboración de alimentos, cervezas y aplicaciones
farmacéuticas, se hace necesaria ahondar las investigaciones para
optimizar el proceso fermentativo para así obtener mayores cantidades
de producción de amiloglucosidasa por esta cepa.
 Referencias
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• Ruiz Paredes, R.; Vásquez Chumbe, J. "Hidrólisis Enzimática de Desechos del Umarí (Poraqueiba sericea
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• Durango Ballesteros, E.; Batista Jiménez, A.; Cepeda Jiménez, I.; Tobón Guzmán, H. "Producción de
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Colombia. www.utadeo.edu.co.