Fundamentos de

Espectrometría de Masa

11 de diciembre del 2013

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 Espectrometría de masa

1- Generalidades

2- MALDI-TOF

3- ESI-Q

4- Peptide Mass Fingerprinting y

tandem MS
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 Espectrometría de masa

1- Generalidades

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 Espectrometría de masa

ESPECTROMETRÍA

Técnica que permite la

separación y determinación de
la relación masa/carga de
iones gaseosos
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 Espectrometría de masa

Espectrometría ≠ Espectroscopía
(Medición de un rango) (implica absorción o
emisión de energía radiante)

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 Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Biomoléculas

Determinación de masa y/o composición:

 Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

 Polisacáridos, oligosacáridos

 Lípidos  Lipidoma

 Fragmentos de ácidos nucleicos

Técnica muy sensible:

puede analizar mg-ng (y menos) de material
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 Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Proteínas

 Determinación de masa y/o composición

 Identificación por comparación con bases de datos

y secuenciación de péptidos

 Modificaciones postraduccionales

 Complejos Supramoleculares:
Interacción entre proteínas
Interacción con compuestos de bajo PM

 Plegamiento

 Niveles de expresión/modificación posttraduccional

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 Espectrometría de masa

cyt C ~ 12000 Da

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 Espectrometría de masa

Espectrometría de masa biológica

Lisozima

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 Espectrometría de masa

Los Iones son importantes

En el proceso de Ionización se forman diferentes
tipos de iones  cambios en m/z:

[M+H]+ o [M-H]-
De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,
fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)

[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-

De la unión de iones especialmente a moléculas que
contienen oxígeno (Na = 23 ; K = 39 )

[M]*+, [M]*-
(oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
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 Espectrometría de masa

PM(péptido) = 1162 Da
Modo positivo Modo negativo

m= +1 +23 +39 -1

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 Espectrometría de masa

Espectrómetro de masa
Muestra

Entrada:
Analizador
Volatilización/ Detector
de masas
Ionización

MALDI TOF
ESI Cuadrupolo Alto
Tampa de Iones Vacío
FTICR
Sector Magnético 12
 Espectrometría de masa

Espectrómetros de masa
(configuraciones para grandes biomoléculas)

MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-

Time of Flight

ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole

ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap

FT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

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 Espectrometría de masa

2- MALDI-TOF

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 Espectrometría de masa

Ionización por MALDI:

(Matrix assisted Laser desorption/ionization)

Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe

energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación
de la muestra:

La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando

la proteína cargada hacia la entrada del analizador.

El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante

un campo eléctrico
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 Espectrometría de masa

MALDI-TOF
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo
a su “tiempo de vuelo”(t).

t  (m/z)1/2
las partículas con menor m/z llegan antes al detector

No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y

tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

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 Espectrometría de masa

MALDI-TOF
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son
acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una
energía cinética:
Ek = zeEs
donde s es la distancia de la región de la fuente.
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa
ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek,

½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D

 m/z = 2eEs(t/D)2
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 Espectrometría de masa

Los Isótopos son importantes

Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos

Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu),

se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu

1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g

Abundancia isotópica:

12C 12.0000 98.90 %

13C 13.0034 1.10 %

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 Espectrometría de masa

3- ESI-MS

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 Espectrometría de masa

ESI-Q
ElectroSpray Ionization - Quadrupole

Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar

sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2
(gas secante).

El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas

cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse
y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador

El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

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 Espectrometría de masa

ESI

N2

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 Espectrometría de masa

ESI-Q
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama
“Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de
un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son
neutralizados y eliminados.

Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible

variar la m/z y realizar un barrido espectral

Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de

electrodos del filtro de masas

Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen

muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
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 Espectrometría de masa

ESI-Q

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 Espectrometría de masa

ESI-Q

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 Espectrometría de masa

ESI-Q

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 Espectrometría de masa

ESI-MS Deconvolución del espectro

14+

13+

12+

11+

10+
9+

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 26

 Espectrometría de masa

Comparación
MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)
Cargas/ion Pocas, en general 1 Muchas
Rango de m/z 50000 3000
Rango de masas 200.000 70.000
Interacciones no No Si
covalentes
MS/MS limitado, PSD Si, CID
Acoplar LC No Si

Tolerancia a Si No
contaminantes

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