Universidad de las Fuerzas Armadas “ESPE”

Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura

Ingeniería en Biotecnología
Biología Molecular I

PCR en Tiempo Real

Integrantes:
Jesús Álvarez
Ruth Escobar
Silvana Romo
Liss Topón
INTRODUCCIÓN

Copias Técnica
del ADN de PCR
en 1971 1983

PCR Reacción
Bromuro
de Etidio Bajo luz
en 1993 UV

Monitoreo Amplific.
“in situ” Exponencial
 Técnica Muestras
sensible pequeñas

Flouresencia
Amplificación y
proporcional al Ct
detección
ADN/ARN

No se Cinética y
necesitan otras eficiencia de la
actividades PCR
Espectro de emisión de los fluoróforos usados en la PCR en tiempo real
Flouróforos

Agentes Ventajas Desventajas

Intercalantes
SYBR Green I

Más sensible que Ajuste de

bromuro de Etidio condiciones
Fluorescencia
con ADN
dúplex Económico No PCR multiplex

Uno para
Baja especificidad
Condiciones de diferentes ensayos
Reacción
óptimas
Sondas de Hibridación

Sondas Sonda corta

Acción de la Liberación de
Taqman Poliemerasa fluorescencia

Molecular Sonda
Molécula
donadora y
Hibridación
Bacons Cerrada
aceptora
ADN blanco

Sondas de Dos sondas

hidrólisis

Iniciador de Sonda unida

Scorpion PCR al primer
Sondas Taqman Molecular Bacons
 METODOLOGÍA
Construcciones de ADN y preparación de estándares de ARN
Cepa PUUV Umea , y la cepa PUUV
Kazan contiene los segmentos M, L
Y 80-S

Regiones de unión de cebador y se

clonaron en el vector pCR II-TOPO

Como resultado el plásmido pCR II-

TOPO pUmU / Kz

Los pares de cebadores se

diseñaron y evaluaron frente a las
secuencias anteriores

Los pares dieron el valor de Ct más

bajo frente a las correspondientes
regiones S, M y L.
Las interacciones del dímero de cebador se investigaron en Oligo Analyzer 3.0 y las interacciones predichas
de Tm y oligonucleótido se encontraron mediante el software OligoCalc
El plásmido pCR II-TOPO pUmU / Kz se linealizó usando EcoRV, corriente abajo del promotor SP6 y el
inserto, y posteriormente utilizado para la transcripción de ARN por ribosonda
La RNA polimerasa del sistema SP6 / T7 y la concentración del ARN producido se determinaron usando un
espectrofotómetro NanoDrop
 Cultivo celular, infecciones y aislamiento de ARN

Veinticuatro placas de pocillos se sembraron con 170,000 células y

se mantuvieron en medio de Eagle modificado

El virus Kazan de la cepa PUUV se diluyó en DMEM libre de suero y se

usó para infectar células una multiplicidad de infección (MOI) de 10, en
un volumen total de 200 μl en cada pocillo.

Los sobrenadantes y las células lavadas se recogieron por separado y se

mantuvieron congelados a -80 ° C hasta su análisis

Las células de los pocillos individuales se lisaron y el ARN total se

extrajo y purificó a partir de estos y se recogieron en agua libre de
RNAasas
 Condiciones de PCR

Los niveles de expresión de ARN de los segmentos S, M y L se cuantificaron mediante qRT-PCR

Llevada a cabo en placas de PCR multiplate de 96 pocillos que contenían 2 μL de ARN y 200 nM de cada
cebador, 12 μL de componentes de la mezcla maestra KAPA

La condición consistió en una incubación inicial de 5 minutos a 42 °C, para la síntesis de ADNc y 5 min
a 95 °C para la activación de la enzima.

Seguido de 40 ciclos, cada uno de los cuales consistió en un paso de desnaturalización a 95 °C,
durante 3 s y un paso de recocido / extensión a 60 °C durante 25 s.
 DISCUSIÓN
La cinética de la replicación viral específicamente Orthohantaviruses necesita más investigación, y hay una
falta de datos publicados sobre los mecanismos de replicación del virus que pueden apoyar este estudio.

Se realizó una investigación de la cinética y los niveles de ARN individuales de la cepa PUUV Kazan
después de la infección sincrónica de las células Vero E6, como marcador de la replicación de
Orthohantavirus

Los resultados mostraron un rápido aumento en la producción de ARN viral en todas las muestras de
células infectadas. Curiosamente, las transcripciones de los segmentos S y M se volvieron más
abundantes que las transcripciones del segmento L tanto dentro de la célula como en el sobrenadante
celular

Los viriones con al menos un segmento S, M y L podrán producir viriones de progenie en caso de
infección, pero no conocemos la frecuencia de viriones de Orthohantavirus completos de este estudio

La producción de RNA viral retardada y prolongada del segmento M, en comparación con los otros
segmentos, podría reflejar la necesidad de glicoproteínas en etapas posteriores de la replicación viral. A
partir de entonces, la transcripción / replicación de los diferentes RNA virales se estancó a diferentes
números de copias y disminuyó a partir de entonces.
 CONCLUSIONES

• Desarrollo de un método para seguir la transcripción / replicación de

Orthohantavirus in vitro después de la infección sincrónica de células Vero.

• Al usar este método, se puede monitorear la producción y los niveles de los RNA
virales individuales de los RNP durante una infección en curso