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aislamiento de células
Estudio de los componentes
celulares
• Implica:
• 1. RUPTURA DEL TEJIDO
• 2. FRACCIONAMIENTO CELULAR
• El fraccionamiento celular es un conjunto de
métodos y técnicas que tiene como objetivo
obtener fracciones puras o enriquecidas de un
determinado componente celular.
ETAPAS
• Todo fraccionamiento tiene dos etapas:
• Ruptura de las células o tejidos para obtener
un lisado celular o tisular en el que la fracción
deseada se encuentre en condiciones
adecuadas para su purificación.
• Separación de fracción deseada del resto de
componentes celulares mediante algún
criterio como puede ser una diferencia de
densidad (centrifugación en gradiente o
diferencial) , presencia de algún antígeno, etc.
Ruptura de células y tejidos
• 1) Homogenización:
• Esferas: choque de vidrio con las células.
• Tamaño de las esferas:
• 0.1mm – bacterias y esporas
• 0.5mm- levaduras, micelios, microalgas,
células animales, celulas tripsinizadas.
• 1.0-2-3 mm cerebro, músculo, piel, hojas etc
• Se utilizan esferas en un 50% del volumen de
biomasa .
Ruptura mecánica. Esferas vidrio
Licuado
• Homogenización por uso de cuchillas. Se
obtiene mejor resultado cuando se usan
detergentes o solventes. Cuchillas rotan a
6000-5000rpm en un contenedor
• Se pueden reducir las partículas a 4 micrones
(buenas para citometría de flujo)
• No se utilice con microorganismos
• Puede haber degradación enzimática
Homogenización con Politrón
Produce poca turbulencia. Protección
de organelos
Menor velocidad y tiempo de
exposición. Genera menos calor
Inconvenientes
Generación de calor
Daño por radicales libres
Se puede usar DTT o sH
Lesión en membrana celular
COMPRESIÓN
Congelamiento-descongelamiento
• Requiere períodos prolongados de tiempo
(hasta 36 h) para el congelamiento-
descongelamioento
• Para tejidos animales y vegetales y masas
microbianas.
• Se utiliza nitrógeno líquido
congelamiento
Requerimientos para la ruptura
• Seleccionar un regulador adecuado: Fosfatos,
Hepes, Mes, Tris etc.
• Realizar la ruptura a pH 7.
• Utilizar inhibidores de Proteasas.
• Mantener una fuerza iónica fisiológica(NaCl
0.15M).
• Utilizar Cofactores.
• Realizar toda la operación en frío.
Después de la ruptura, viene la
centrifugación
• Para separar partículas biológicas en una
suspensión, se utiliza la fuerza gravitacional
empleando la centrifugación.
• Manejando las variables de fuerza centrífuga y
tiempo podemos separar los organelos
dependiendo de su tamaño.
• En centrifugaciones sucesivas se obtienen las
fracciones de interés.
PROCEDIMIENTOS DE
CENTRIFUGACIÓN.
• Hay dos tipos:
• Preparativa: para el aislamiento de partículas
específicas
• Analítica: Medida de las propiedades físicas de
una partícula al sedimentar.
Tipos de centrifugación
• Centrifugación diferencial. Se basa en la diferencia de
densidad de las moléculas.
• Centrifugación isopícnica. Para separar partículas con la
misma densidad. Se utilizan gradientes de densidad como
CsCl (p ej DNA)
• Centrifugación zonal: Separación por diferencia de masa.
Sedimentan a diferente velocidad. Se utilizan gradientes
preformados (sacarosa, glicerol). Cuidar el tiempo de
centrifugación, de lo contrario se van al fondo.
• Ultracentrifugación.. Para estudiar las características de
sedimentación de partículas
Centrifugación diferencial
• La muestra es centrifugada a una velocidad
dada. Se obtiene un sobrenadante y una
fracción sedimentada (pellet).
• La muestra es aislada de acuerdo a su
velocidad de sedimentación, a una fuerza
centrífuga constante, y es proporcional al
tamaño de la partícula.
• Desventaja: El pellet es una mezcla de todos los
componentes sedimentados.
• Rotor utilizado: de ángulo fijo o de columpio.
Centrifugación diferencial
NOMOGRAMA