TECNICAS HISTOLOGICA

 La Histología incluye el estudio de las células, los

tejidos, los componentes extracelulares y los
órganos
 Previamente debemos conocer las unidades de
medida que se utilizan en Histología
 Los componentes de las células y los tejidos se
miden utilizando el sistema métrico. Las
unidades que se utilizar son el milímetro (mm), el
micrómetro (un) y el nanómetro (nm)
 Equivalencias:
- 1mm = 10-3 m
- 1 un = 10-6m
- 1 nm = 10-9m
 El ojo del ser humano puede ver desde un
tamaño de 0,2 mm equivale al grosor de una
hoja de afeitar
 La microscopia óptica puede observar figuras
desde un tamaño 0,2 un ( 100 nm) que equivale
al tamaño de un virus
 La microscopia electrónica de transmisión puede
observar figuras desde un tamaño de 0,2 nm que
equivale al tamaño de un átomo
 La microscopia de efecto túnel puede observar
figuras de tamaño menores de 0,1 nm o sea
menor que el tamaño de un átomo
 Para su estudio, las muestras se pueden dividir en:
Muestras liquidas y muestras solidas
 MUESTRAS LIQUIDAS: Muestras de humores,
secreciones (sangre, saliva, liquido vaginal, orina,
leche, etc..)
 MUESTRAS SOLIDAS: Muestras de tejidos u órganos
- Necropsias : Examen u obtención de tejido de un
organismo muerto
- Biopsia: Examen u obtención del tejido de un
organismo vivo
Se utilizan diversas técnicas para la obtención de la
muestra, como ser: Inscinsional, excisional por
sacabocados, por punción, absorción y raspado
 Obtención de la muestra (Punción, incisión,
raspado, absorción)
 Fijación
 Deshidratación
 Aclaramiento
 Impregnación
 Corte
 Montaje
 Tinción
 Estudio
 Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias
químicas que tienen varias finalidades:
- Conservar los tejidos
- Aumentar la dureza del tejido para facilitar el corte para la
preparación de finas películas
- Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos
- No cambiar significativamente de forma y/o volumen
- Los tejidos fijados permiten una correcta y clara tinción de los
mismos
- Los tejidos fijados deben en lo posible mantener las mismas
características de los tejidos vivos, por lo tanto, los fijadores
mantienen la estructura celular con la menor variación posible
- Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la
muerte de la célula. Esto se logra al inactivar ciertas enzimas
celulares que de otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la
degeneración post mortem
 Los agentes fijadores mas utilizados son:
 Formadehido al 5%
 Formol al 10% o formalina (el mas utilizado)
 Glutaraldehido al 2,5%
 Es muy importante este paso porque depende
de el, el estudio de la muestra.
 Cuando se hace una mala fijación es
imposible observar en el microscopio las
estructuras de un tejido
 El agente fijador mas usado es el formol al
10% o Formalina
 Es el proceso que se desencadena en la célula desde el
momento que deja de recibir un normal aporte de oxigeno
o de nutrientes. La muerte celular produce la autolisis y la
total alteración de las características estructurales de la
célula
 La autolisis ocurre por que la falta de oxigeno y de
nutrientes interrumpe la producción de ATP (molécula
energética). En la membrana plasmática de la célula
existen una serie de proteínas que activamente (con gasto
de ATP) mantienen las concentraciones iónicas normales
dentro de la célula
 La falta de ATP detiene el funcionamiento de estas
proteínas lo que produce la entrada anormal de iones
principalmente, sodio, cloro y calcio. El sodio y el cloro
atraen el agua que a su vez produce un edema en la célula
 El calcio activa una serie de enzimas intracelulares
(fosfolipasas) que perforan las membranas de las
organelas
 Dentro del conjunto de organelas la destrucción de las
membranas de los lisosomas produce la mayor alteración
de la célula
 Los lisosomas son vesículas delimitadas por membrana
plasmática que contiene una batería de enzimas
hidrológicas: fosfatasa acida. Ribonuclease, proteasa,
sulfatasa, lipasa, glucuronidasa
 Todas estas enzimas digieren proteínas, lípidos, ácidos
nucleídos, etc.
 La liberación anormal de estas enzimas dentro de la
propia célula degrada su citoesqueleto y sus organelas
 Por tanto la fijación de los tejidos debe ser sumamente
rápida para evitar el comienzo de estos cambios
 Para comprender los siguientes pasos
debemos saber que nuestro fin es preparar
una muy fina rebanada de tejido para colocar
arriba de un portaobjeto y observarla en un
MO
 Debe ser una fina capa de tejido para que la
luz del microscopio la atraviese y observemos
bien cada uno de los detalles
 Antes de cortar el tejido el mismo debe ser
incluido en un medio rígido que nos permita
hacer cortes muy finos (5 a 15 un)
 El medio de inclusión utilizado en forma
rutinaria es la parafina
 Por lo tanto, ahora debemos hacer que la
parafina se introduzca dentro de la muestra
fijada
 La muestra hasta ahora se halla en un fijador
acuoso y la parafina no es soluble en agua,
por lo que la muestra debe ser deshidratada
 Se elimina el fijador y se extrae el agua del
tejido
 Para evitar un cambio de volumen brusco por
la deshidratación (distorsión del tejido), se
aplica una serie gradual de soluciones de
alcohol de menor a mayor concentración,
 Por ejemplo: iniciando con alcohol al 50%,
luego con una solución al 60%, 70%, 80%, 90%
y alcanzando de manera paulatina el alcohol
al 100% para lograr la deshidratación del
tejido
 Consiste en introducir el tejido deshidratado en
una solución que sea miscible tanto con el
alcohol como con el medio de inclusión la
parafina
 La sustancia utilizada es el Xileno o Xilol que es
soluble en alcohol al 100%
 Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el Xileno, esto se debe a
que cambia su índice de refracción
 El alcohol y el Xileno disuelven los lípidos de la
célula y por lo cual al extraerse también se
extraen las grasas y los lípidos de la célula
 La inclusión es el método mas común de endurecer el
tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias
liquidas que tras un proceso de polimerización o
enfriamiento se solidifican, sin afectar a las
características del tejido, esta sustancia es la parafina
 Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde
decenas de un a nm según el medio de inclusión) sin
que el tejido se rompa o se deteriore
 Además es un buen método de preservar las
muestras durante largos periodos de tiempo. Existen
diferentes sustancias o medios de inclusión
dependiendo del grosor del corte y de la técnica que
necesitemos realizar
 La parafina liquida penetra al tejido al colocar la
amuestra del tejido en un recipiente y se le
agrega la parafina fundida 60ªC, colocando la
muestra en una estufa por 30 minutos a 6 horas
manteniendo la temperatura a 60ªC, la muestra
es transferida a través de tres baños sucesivos de
parafina
 Por el calor el Xilol se evapora y los espacios son
ocupados por la parafina
 Posteriormente se coloca el tejido en un molde
de metal de forma rectangular y se espera que se
solidifique para formar un bloque solido de
parafina denominado taco
 SECCION O CORTE: Una vez que tenemos el taco
se puede cortar en secciones lo suficientemente
delgados (3 a 5 micrómetros) como para permitir
el paso de la luz
 Para realizar el corte se utiliza un aparato
llamado Micrótomo
 MONTAJE: Obtenidos los cortes todavía no son
aptos para su examen con el MO, puesto que los
tejidos se hallan en parafina y carecen de color
 Se colocan en baño maría y se realiza el montaje
en un portaobjeto al que se agrega una pequeña
cantidad de albumina que actúa como adhesivo
 Consiste en dar color a las diferentes estructuras de
la célula. Los colorantes en general se hallan
disueltos en soluciones acuosas
 Previo a la tinción la muestra debe seguir un proceso
previo donde es necesario rehidratarlos, para lo cual
se debe eliminar la parafina y se incluyen en Xilol, y la
muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie
de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta
llegar a una solución de agua
 Ya rehidratado se tiñe al tejido. Los colorantes mas
utilizados son la hematoxilina colorante básico que
tiñe de azul las estructuras acidas de la célula y la
eosina que tiñe de rosado las estructuras básicas de
la célula ( técnica Universal)
 Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que
puede fijarse de modo permanente el cubreobjetos con un medio
adecuado para el montaje( por ejemplo una gota de Bálsamo de
Canadá o similar)
 Luego de la tinción en el o los colorantes, debemos obtener un
preparado permanente. Por lo tanto hay que quitarle el agua y
prepararlo para colocarle un cubreobjetos
 En el Xilol el corte se aclara ( ya sabemos las propiedades del
Xilol) y se hace mas translucido y nítido en el MO. Pero aun
debemos colocarle un cubreobjetos para no dañar el corte con el
objetivo del MO. El cubreobjetos se adhiere al corte colocando
una gota de bálsamo sintético
 Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en
agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la
deshidratación después del teñido, se puede montarlo
directamente. El cubre objetos no solo protege el tejido , sino
que se requiere para observar el corte con un microscopio