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MICROSCOPIA

 Técnica de observación y estudio,


de objetos no visibles a simple vista.

 Robert Hooke.1660-1665.
 Microscopio compuesto
 Hongos filamentosos.

 Antonie van Leeuwenhoek. 1684


 Microscopio simple
 Bacterias
 y protozoarios.
Microscopio
 Tipos microscopios:
 Simple: Una lente: Lupa.

 Óptico/Compuesto: Tiene dos o más sistemas de lentes (ocular y


objetivo): luz visible.
- Trabajo de rutina Microb: Forma , agrup, esporas?

 Electrónico: Sistema de imanes para guiar el flujo de electrones,


hacia el objetivo.
 Estructuras intracelulares.
 M. Efecto Túnel; MFA. Ubicuidad del e; Efecto cuántico;
Potencial, corriente túnel
 Estructuras atómicas
 El microscopio óptico, compuesto:
 Tipos de microscopios ópticos/Luz:
Campo claro.
Campo oscuro.
Contraste de fases.

Fluorescencia, Luz UV
Confocal, Laser
 El microscopio Óptico, campo claro:
Dos series de lentes : Objetivo y ocular.

 Luz visible
 Producción imagen :
 Células , componentes, m. ambiente.
 abs-dispersan luz, dif grados:
 Diferencias contraste: Imagen
 Tinciones (Microorganismos pigmentados).
Componentes básicos de un microscopio

Microscopio de campo claro


Oculares

Brazo
Revólver
Objetivos
Condensador
T. Macrométrico
T. Micrométrico
Diafragma iris
Lámpara
Platina
T. del carro
Base
Fundamentos de óptica: Aumento y
Resolución:
Fundamentos de óptica: Aumento y Resolución:
 CAPACIDAD DE AUMENTO/SIN LÍMITE (1000-1500X).
 RESOLUCIÓN: Limitada, propiedades físicas lente (0j0)y luz
(Visible). limitada 400-700 nm.
 Poder resolución del ojo humano;
◦ Límite de lo que se puede ver.
◦ Ojo humano: 0.2 mm = 200.0 micras 200,000 nm

◦ M óptico 0.2 micras= 200 nm. (1000X)


◦ M electrónico 0.0002 micras 0.2 nm (1000X)

Poder de resolución de una lente

- resolución +
Lente A B C D

•Valor más importante, PODER DE RESOLUCIÓN-


•Poder de Resolución: Capacidad lente distinguir dos puntos
próximos/ separados.

•Límite de resolución (d): LR = l/ 2AN ( =0.8/0.6/0.4/0.2 micras )


• Distancia mínima entre dos puntos/ entidades separadas
• Dos objetos separados 0.2 micras
Límite de Resolución (PR) depende dos factores:
•Longitud de onda: LR =  / 2 N
•400-700 nm.
-PR=Inversamente proporcional.

RESOLUCIÓN:
Limitada, propiedades
físicas lente y luz.
Filtro de luz azul
Poder de Resolución
depende dos factores:
LR =  / 2 N
APERTURA NÚMERICA=AN
•Directamente proporcional

•Apertura Numérica depende de:

•AN = n (sen θ/2)

•Depende Apertura angular


•Índice refracción

•n=IR
•sen θ= Apertura Angular, AA
La apertura angular. Lente objetivo.
-Apertura angular AA:
-AA= ½ del Angulo, entre los rayos de luz más
divergentes, salen de la preparación, musetra,
objeto, y entran al objetivo

-Capacidad de las lentes objetivo captación/


admitir luz.

-Lentes objetivo:
-Plano convexos, muy pequeños,
-Apertura angular/visual= muy
angosta.

•AN = n (sen θ/2)


Rayos de luz, no entran objetivo: ángulo divergencia mayor AA (u)
•AN = n (sen θ/2)
LR =  / 2 N

η aire = 1,0 ( Rayos, ángulo


más grande AA, se pierden)  aceite = 1,5 (Rayos, perdidos
refracción y reflexión, dentro AA
)
La Apertura Numérica (NA):

 Uso AI:
 LENTE-OBJETIVO llevada más cerca del objeto:
 Distancia de trabajo, disminuye de 1.8 mm a 0.2 mm.
 Captando más rayos divergentes.
 Incrementa, Poder de Resolución.

100X

40X
Límite de Resolución:
 530 nm

 Ejemplo:
100x 1.3 N.A. objetivo a 530 nm=
0.53 um

0.53
= = 0.20 m
2 NA 2 X 1.3

40 x 0.65 N.A. objetivo a 530 nm



= 0.53 = 0.4 m
2 NA 2 X 0.65
Tipos de microscopios ópticos/Luz:
Microscopio de campo obscuro:

• Objetos iluminados, campo obscuro


• Gran Poder resolución:
• Mayor , campo claro o contraste fases

• Visualizar preparaciones húmedas, de


Mo. vivos sin teñir .
Movilidad de mo: Obs flagelos.
• Uso de aceite de inmersión
Microscopio de campo oscuro:
• M.óptico: Sistema iluminación modificado:
 Condensador especial, previene la entrada de los rayos de
luz centrales en el objetivo. Solo periféricos
 Sustituir condesador Abbé X Condensador de campo oscuro
 (Cardioide y Paraboloide)
• Luz sobre preparación, solo en forma oblicua: campo vacío, oscuro.
• Presencia de muestra, refracta luz hacia objetivo.
• Mo brillantes/campo oscuro.
Campo obscuro
Campo claro

Microscopio de campo obscuro


Gran Poder resolución:
Mayor campo claro o contraste fases

Mo. vivos sin teñir .


Movilidad de mo: Obs flagelos.
Microscopio de contraste de fases:

• Imagen oscura/fondo brillante


• Preparaciones en fresco, /No tinción.
• células vivas, estructuras internas.
• Tinciones. Muerte/distorsión

• Fritz Zernike: Premio nobel Física , 1953


Microscopio de contraste de fases:
• Aumentar las diferencias de contraste
• ENTRE CELULAS-M. AMBIENTE:

• Rayos de luz, célula, Retardados: Amplificado:

-Diafragma especial anular, antes condensador


-Disco transparente, Placa cambiadora de fase,
Objetivo=Retarda o avanza ¼ L.
• Imagen oscura/fondo brillante
 Convierte “diferencias de fase” en “diferencias de
intensidad”
 Luz incidente sobre muestra: dos rayos

Directo. Pasa alrededor del objeto, pasan otra parte del


anillo transparente: no avanzado, ni retardado. Directa

Refractado.
Los rayos que , pasa través del objeto, se enfocan anillo,
retardado o avanzado ¼ long onda respecto a primero.
Refractada
Perceptible al ojo humano
Cambio de fase.
Los rayos se amplifican.(Brillante)
Los rayos interfiere . (Oscuro).
Directa

Refractada

•Imagen oscura/fondo brillante


Cambio de fase.
Los rayos se amplifican.(Brillante)
Los rayos interfiere . (Oscuro).

•Imagen oscura/fondo brillante


Microscopio de contraste de fases
Microscopio de contraste de fases

Campo claro Campo obscuro Contraste de fases

•Estructuras internas células vivas


 Visualizar muestras, emiten fluorescencia.

Fluorescencia:
 Capacidad de un objeto de emitir rayos de una longitud de onda
diferente, mayor, a los rayos incidentes
 Luz incide es de menor λ.

Microscopio de fluorescencia
 Visualizar muestras, emiten fluorescencia.
 Capacidad de Fluorecer :
 Auto florescencia (clorofilas)
 Colorantes fluorescentes: fluorocromos
 Sulfato de quinina,
 Auramina
LR = / 2 N
Microscopio de fluorescencia
 La muestra se tiñe con una sustancia fluorescente: se
ilumina con luz de ondas cortas (UV), invisibles,/emite
luz longitudes ondas más largas (verde).

-Objetos invisibles Luz UV (150-350 nm).


- Visibles con:
 Sulfato de quinina, fluórese a violeta 400 nm.
 Auramina, fluórese a 600 nm. amarillo
 Visualizar muestras, emiten fluorescencia.

 Microbiología Diagnóstica:
◦ Bacilo de tuberculosis.
◦ Inmuno-fluorescencia: Sustancia fluorescente se
une a anticuerpo específico, contra ciertos mo.
Técnica, área clínica

Microscopio de fluorescencia
 Dispositivos especiales:

◦ Luz UV
◦ Filtro opaco al UV, Tubo micro: Protección de ojos.
◦ Lámparas/filtros (selección )
◦ Condensador
◦ Uso de fluoro-cromos
Condensador

Fluorescencia

Contraste de fases Lámpara


(uv)

Microscopio de fluorescencia
Microscopio Confocal. de barrido láser.
 Fuente de iluminación, luz de
un láser.
 Potente y monocromática
 Excita en muestra fluorescencia.
 Espécimen iluminado con luz de cierto
color, éste emitirá luz brillante otros
colores.

 contraste impresionante/
 fondo oscuro.
 Se retratan distintos planos, se
integran: Tridimensional.

 Imagen tridimensional Rotada:


◦ Estudiar la muestra desde un ángulo distinto/
cual se retrató.
Microscopio
confocal de
barrido
láser
Microscopio
confocal de
barrido
láser
Microscopio electrónico de transmisión
TEM: Transmision Electron microscope

1930.-Radiaciones electromagnéticas LR =  / 2 N
long onda e, 0.5 nm.
Luz visible 400-700.0 nm

M óptico 0.2 micras= 200 nm.


M electronico: LR= 0.0002 micras 0.2 nm
( 1000 veces M op).
 Lentes opacos e.
 e , desviados y enfocados, campos magnéticos
vacio. Función Lentes.

 1938, Von Borries y Ruska, Berlin;


Hillier y Vance RCA, USA.

 1940, primer micro e , comercial.


Condensador: Imagen real . 2000x
Fuente iluminación: electrones
transmitidos (filamento tungsteno)
Cátodo
Condensador:
Enfoca,e transmitidos muestra
Muestra
Eq Objetivo: e-
Imagen real . 2000X
transmitidos

Muestra
Eq Ocular: Imagen real .
250,000 X

Pantalla fluorscente: Imagen, 4-6 veces. Electrones


dispersados
1-2x 10( 6)X: Monitor TV ordinario
Pantalla
Microscopio electrónico
Transmisión
Microscopio Electrónico de Transmisión
Microscopio electrónico de transmisión
TEM: Transmision Electron microscope

 Muestras:
 Contraste adecuado:

 Material biológico ( C, H, O, N)= transparentes a. e)


◦ Grado desvió electrones: diferencias contraste.

 ácido ósmico; permanganato; uranio; lantano o plomo


 ( alto PM):

 Haz electrones, bajo poder de penetración:

- Célula aislada-gruesa
- Cortes ultrafinos: 0.02 u. ( metacrylato, ultra-microtomo-
diamante)
Microscopio electrónico de
transmisión
TEM: Transmision Electron
microscope

 Poder resolución:
 Estructuras sub-celulares: ac nucleicos.
Microscopio electrónico de transmisión
TEM: Transmision Electron microscope
Microscopio electrónico de barrido.
SEM: Scanning Electrón Microscope.

 Fuente de e;
 pistola de tungsteno caliente,
 hexaboruro de lantano
 Haz e, barre superficie muestra.
 E desviados, dispersados pantalla, imagen.
◦ Tercera Dimensión: Solo Superficie
◦ Aumentos: 100,000 X.
◦ .
◦ Cámaras; Microfotografías electrónicas.

◦ 1960. SEM comercial.


Microscopio electrónico de Barrido
Microscopio electrónico de barrido

 Preparación muestras sencilla:


◦ . Muestra, recubre fina capa, vapores metal pesado: oro
(Sombreado).
 Imágenes gran profundidad: efecto tri-
dimensional
◦ TEM, profundidad muy limitada, especímenes muy delgados

Esporas

dmáx.= 10 nm
 Campylobacter jejuni

Bacillus

S aureus

Diferencias: aspecto y textura, G- y G+.


Microscopía electrónica

1-2x 10( 6)X: Aumentos:


Estructuras sub-celulares:
, ac nucleícos. 100,000 X.
Extraordinaria
Profundidad:
Topografía,
superficial celula,
Tercera Dimensión
Microscopio efecto túnel
Microscopio Efecto Túnel
 imágenes, Mapas muy precisos de superficies Atómica de
metales o de materiales semiconductores,

 Efecto túnel, BASADO:


 UBICUIDAD e: Nube de posiciones, mecánica cuántica:
diferencia de potencial eléctrico.
◦ Ubicuidad, permite E, escapa del átomo, escapando de las fuerzas
electromagnéticas provocando un túnel .
Microscopio Efecto
Túnel

 El microscopio aprovecha habilidades


escapatorias de e.

 Una sonda (extrem fino, e punta) se acerca a una


distancia muy corta (diez millonésima mm) superficie
metal a observar:

 Los e superficie del metal,


pueden, abandonar los átomos
de origen. Creando,
 “túnel cuántico:
 "corriente túnel",
 “diferencia de potencial
eléctrico”.
“túnel cuántico:
"corriente túnel", “diferencia de
potencial eléctrico”.

Microscopio de Efecto Tunel


Microscopio Efecto Túnel
 La intensidad de "corriente túnel" depende
de distancia sonda-superficie.

 A medida que la sonda barre la superficie, la


intensidad de la "corriente túnel" va informando
sobre el relieve y la topografía estructura
atómica. del metal:

 La resolución del microscopio, espectacular:
 PR (LR)=menos de un décimo del radio
promedio de un átomo:

Mapas muy precisos de
superficies de metales o
de semiconductores, en
los que cada átomo
puede distinguirse de su
vecino
También imágenes
atómicas de moléculas de
ADN.
 El Microscopio de fuerza atómica (AFM: Atomic Force Microscope).

 Registra topografía, sonda o punta afilada, piramidal o cónica.


 Laser
 No requerido, conductores o Semiconductores.: Muestras biológicas
 (1x10 − 9m = 1nm).


Utilidad:.
Investigaciones neuroquímicas:
Estudios de Neurotransmisores (SNC) Mal de Parkinson y Alzheimer.

 ESM IPN, Análisis de:


muestras biológicas,
 formas farmacéuticas y
otros materiales orgánicos e inorgánicos