Southern blot, Western blot,

Northern blot
Isila Bonilla
Mónica Cuentas
Johanna Galán
Frank Ortiz
Angie Rueda
Daniela Ruiz

Carlos Grande
Docente

Universidad del Atlántico

Facultad de ciencias básicas
Programa de química
Biotecnología
2017-1
 Técnicas de Inmunotransferencia que permiten la
detección de fragmentos de DNA y mRNA
específicos con sondas de DNA

Estas técnicas permite la detección de fragmentos de DNA

que son complementarios a fragmentos monocatenarios
de secuencia conocida (sondas).
Southern
blot
Es un fragmento de tamaño variable de
pocos nucleótidos, que puede ser ADN Western
o ARN, que se une específicamente por Técnicas blotting blot
complementariedad de bases a la 5
secuencia que se encuentra en la Northern
membrana de nylon junto con cientos blot
de fragmentos más.

Biologia celular y molecular, Harvey lodish, 5a Edición 2005,Editorial Medica Panamericana S.A.
 Southern blot
Es un método de biología molecular
que permite detectar la presencia de
una secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este ácido nucleico.
Biólogo. Edwin Southern 1975.
Emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa
con el fin de separar los fragmentos de ADN de
acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a
una membrana en la cual se efectúa la hibridación de
la sonda.
Método Southern blot.
Pasos para realizar Southern blot
Extracción del ADN

Southern blot Digestión del ADN

Electroforesis en gel de agarosa

Preparación del ensayo

Hibridación con sonda radioactiva

Detección de los RFLPs mediante

autorradiografía

Reensayar el resultado del Southern con

sondas adicionales
.
Biología, Neil A. Campbell, Jane B.Reece, 7a Edición 2004,Editorial Medica Panamericana S.A
 Extracción del ADN: Se puede extraer ADN de
1 casi cualquier tejido humano.

Digestión: el ADN extraído de la muestra se trata con una

2 endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el
ADN bicatenarios en donde tenga una secuencia característica.

Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los

3 fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño
mediante electroforesis en geles de agarosa.

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN

4 Preparación de un ensayo de Southern
separadas se desnaturalizan mientras
permanecen en el gel de agarosa, impregnando
éste con una disolución alcalina. La
neutralización de ésta, el DNA monocatenario
resultante se transfiere a la superficie de una
membrana de nailon, realizando así una copia.
 Hibridación con sonda radioactiva: Una sonda de
5
locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN
capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de
restricción concreto en el ensayo de Southern.
Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las
6 posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre
la membrana del ensayo de Southern se detectan
mediante autorradiografía

Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: Perfil de ADN.

Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda,
7
se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una
segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se
repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus
diferente.
Procedimiento

Esquema representativo de cada uno de los pasos

involucrados en la técnica de Southern blot.
Obtención del DNA genómico y digestión con
enzimas de restricción, electroforesis,
transferencia, hibridación específica con una sonda
y detección de la secuencia de interés.
 Southern Blot

Masayuki Kimura, Rivka C Stone, Steven C Hunt, Joan Skurnick, Xiaobin Lu, Xiaojian Cao, Calvin B Harley & Abraham
Aviv. 2010. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.
Nature Protocols, 5, 1596-1607.
 Fig.2. Evaluación de la integridad del ADN.
• Muestras de ADN (10 µg) fueron resueltos en gel de
agarosa 1% (peso/vol) a 200 V durante 60 minutos.

Fig.1. Resumen de la metodología utilizada.

 Fig.3. Digestión genómica de la restricción de DNA.

Fig.4. Resolución de análisis de la longitud del TRF en geles de

agarosa de varios porcentajes. (a) gel de agarosa de 0.6% (peso/vol),
(b) un gel 0.5% (peso/vol) y (c) gel 0.3% (peso/vol).
 Fig.6. Señal TRF
sugiriendo la degradación
del ADN antes de la
digestión enzimática.

Fig.5. Análisis Southern Blot de TRF en leucocitos

Western blot
WESTERN BLOT
• Técnica importante utilizada en la biología celular y molecular.

• Mediante el uso de una transferencia de Western, los investigadores son capaces de

identificar proteínas específicas de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las
células.

• Elementos para realizar esta tarea:

1. La separación por tamaño
2. La transferencia a un soporte sólido
3. El marcado proteína objetivo utilizando un anticuerpo primario y secundario adecuado
de visualizar.

Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. Technical Article. 2015
WESTERN BLOT
Realizar una electroforesis que separa las proteínas según un determinado criterio, una
transferencia del gel resultante, a una membrana adsorbente, posteriormente se detecta
la proteína de interés, se estudia la unión antígeno-anticuerpo, y se observan los
resultados.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT

• Electroforesis discontinua: Electroforesis donde hay dos tipos de geles, un gel

concentrador y un gel separador.

• PVDF: Fluoropolímero inerte químicamente.

• Anticuerpo: Inmunoglobulinas. Son glucoproteínas que neutralizan elementos

externos (antígenos), como bacterias, parásitos, virus.

• Antígeno: Proteínas o polisacáridos. Sustancias externas que desencandenan la

formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria mediante la
activación de linfocitos.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
• PBS (Tampón fosfato salino): Solución acuosa y salina que contiene cloruro de sodio,
fosfato de sodio, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Se usa principalmente para
mantener un pH estable.

• SDS: Dodecil sulfato de sodio. Detergente de carga negativa. Se une a las proteínas y
les confiere dicha carga. Esta unión se da en una proporción constante, cada gramo de
proteína se une a 1,4 g de SDS, sea cual sea la proteína.

• Anticuerpo primario: Se une y marca la proteína de interés.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
• Anticuerpo secundario: Determinan si el anticuerpo primario se unió a la proteína de
interés, los hay de diversos tipos según como los queramos o podamos detectar luego:
Ligados a enzimas (veremos un cambio de color), de marcado radiactivo, de marcada
fluorescente.
• Anticuerpo monoclonal: Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos idénticos,
porque son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune. Se unen a un
epítopo en partícular, una única región del antígeno.

• Anticuerpo policlonal: Son anticuerpos derivados de diferentes tipos de linfocitos. Los

anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulinas secretados en contra de
un antígeno concreto.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
¿Cómo se prepara y realiza un Western Blot?

Preparación de la muestra

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
Electroforesis en gel

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
Transferencia
Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia).

• Las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las

interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de
interacciones no covalentes de naturaleza hidrófoba.

• Las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos

entre la membrana y las proteínas.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
• Difusión simple: se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la
membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar
el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este
montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el papel de
filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas
en ella.

• Transferencia al vacío: se añade el poder de succión de una bomba conectada a un

sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la
superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este método es válido tanto para
proteínas de alto como de bajo peso molecular.

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
Electrotransferencia

https://scykness.wordpress.com/2013/07/16/entendiendo-un-western-blot-o-al-menos-intentandolo/
WESTERN BLOT
• Bloqueo: debido a que las proteínas se unen de forma inespecífica a la membrana, se
debe bloquear los lugares de unión que han quedado libres (sin unión de proteínas).
 albúmina de suero bovino (BSA).
 leche en polvo .
 caseína.
 algo de detergente, como Tween 20.

.
De, A.; González, F.; Lozano, J. R.; Capdevila, E. F. Análisis de Proteínas Mediante Electroforesis E Inmunotransferencia. PIEL. Form. Contin. en dermatología 22 (5), 252–258
WESTERN BLOT
• Detección :
 Incubación de anticuerpo primario: se baña la membrana en una solución de
anticuerpos, aquí se da la unión de la proteína con el epitopo del anticuerpo primario.
 La membrana es lavada comúnmente con TBS o TTBS, para retirar los anticuerpos no
unidos.

De, A.; González, F.; Lozano, J. R.; Capdevila, E. F. Análisis de Proteínas Mediante Electroforesis E Inmunotransferencia. PIEL. Form. Contin. en dermatología 22 (5), 252–258.
WESTERN BLOT
• Detección :
 anticuerpo secundario : Éste reconoce de forma específica una región concreta del
anticuerpo primario, a la cual se une, los anticuerpos secundarios suelen estar marcados
para ser detectables por diversos métodos (entre ellos una enzima ej: peroxidasa)

De, A.; González, F.; Lozano, J. R.; Capdevila, E. F. Análisis de Proteínas Mediante Electroforesis E Inmunotransferencia. PIEL. Form. Contin. en dermatología 22 (5), 252–258.
WESTERN BLOT

• Análisis :
 Análisis colorimetrico: con un sustrato unido al anticuerpo secundario que es una
enzima “reporter” , (una peroxidasa, por ejemplo) , produciéndose una reacción que
acaba en un cambio de color, la cuantificación proteica se evalúa por densitometría
(intensidad o densidad de la proteína, de lo que vemos de proteína, de la “mancha”) o
por espectrometría, que nos indicará un determinado valor de longitud de onda,
equivalente a una determinada cantidad.
 Análisis fluorescentes: marcadores fluorecentes que van unidos al anticuerpo secundario,
a los cuales se les excita luminicamente, y se detecta su cambio mediante un fotosensor.(
camara CCD) la imagen digital puede ser analizada para obtener el peso molecular o la
cuantificación proteica.

Thermofisher scientific, Overview of Western Blotting; Protein Biology Resource Library. (www.thermofisher.com)
WESTERN BLOT
• Análisis :
 La detección quimioluminiscente: en la incubación de la membrana un sustrato que trae
unido el anticuerpo secundario emitirá luminiscencia al ser expuesto al “reporter” . El
más usado es el luminol, la imagen se analiza por densitometría.

Thermofisher scientific, Overview of Western Blotting; Protein Biology Resource Library. (www.thermofisher.com)
WESTERN BLOT

• tipos :
 Directo: anticuerpo unido enzima
 Indirecto: anticuerpo primario + anticuerpo secundario + conjugado

Thermofisher scientific, Overview of Western Blotting; Protein Biology Resource Library. (www.thermofisher.com)
1. Teoría
El northerm blot fue
desarrollado en 1977

Es una técnica de
identificación y
localización de moléculas
de ARNm de una
secuencia dada dentro
David Kemp James Alwine George Star de una mezcla compleja.
 2. Preparación

PASO 1. Aislamiento del ARN

D. Lovatt., J. Eberwine, Northern Blotting, In Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition) (2013) edited by Stanley Maloy and Kelly
Hughes, Academic Press, San Diego, Pages 105-107
 EXTRACCION DEL ARN

TRIzol (tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo) centrifugar

isopropanol

centrifugar +
Total ARN Remover fase
acuosa
ARN

D. Lovatt., J. Eberwine, Northern Blotting, In Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition) (2013) edited by Stanley Maloy and Kelly
Hughes, Academic Press, San Diego, Pages 105-107
 PASO 2. Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar los fragmentos de ARN por
tamaños. ARN Muestras
marcador de ARN

Cuando la fuente de Más grandes

poder se enciende los
fragmentos de ARN
migran a través del gel
Más pequeño

Paso 1. Paso 2. Paso 3.

Los fragmentos ahora están
separados por tamaños

D. Lovatt., J. Eberwine, Northern Blotting, In Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition) (2013) edited by Stanley Maloy and Kelly
Hughes, Academic Press, San Diego, Pages 105-107
PASO 3. transferencia del gel a membrana de nylon

Charola de solución Espaciadores

buffer

Se adhieren los RNA a la

Gel membrana de Nylon.

Membrana de
nylon
Solución buffer
 PASO 4. HIBRIDACIÓN ESPECIFICA : Sonda de ADN

La sonda es un fragmento de ácido nucleico con una secuencia de

nucleótidos conocida, que pueden unirse con una alta especificidad
a una secuencia complementaria de acido ribonucleico de cadena
sencilla.

Isotopos radiactivos o con Emisión de luz

quimioluminiscencia

Lodish, H. Biología celular y molecular. (2005). Ed. Médica Panamericana. pg377

34
Proceso de Hibridación Especifica
La hibridación es la capacidad que tiene la sonda de ADN para
aparearse, unirse y formar moléculas de cadena doble.

un tampón de hibridación el cual de manera estándar

contiene NaCl 5 M, Tris / HCl 1 M, Formamida, agua
destilada y Sonda marcada de interes.

Elimina:
sitios de unión inespecíficos
La sonda de ADN marcada radioactivamente se sonda que no se unió
une solo a regiones del filtro en las que están Lavado
localizado los fragmentos de arn de interés.

Rodríguez Martínez, R. (2011). Empleo de la técnica hibridación in situ fluorescente para visualizar microorganismos. Revista de la
Universidad Industrial de Santander. Salud, 43(3). 35
 PASO 6. Visualización del ARN

Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño
de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se
une al ARN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ARN brillarán, lo cual nos permite
ver el ARN presente en distintos lugares a lo largo del gel.
Muestra
Marcador

5000 pb Comparación
Podemos determinar su
1500 pb
tamaño aproximado.
~700 pb
500 pb

D. Lovatt., J. Eberwine, Northern Blotting, In Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition) (2013) edited by Stanley Maloy and Kelly
Hughes, Academic Press, San Diego, Pages 105-107
APLICACIONES
• Detecta la presencia de moléculas especificas de ARN en una
muestra en especifica.
• Examina patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y en
adultos.
• Caracteriza y cuantifica la actividad transcripcional de un gen
determinado en distintas células, tejidos y organismos.
• Muestra la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de
genes supresores tumorales en celula cancerosas cuando so
comparadas con tejidos normales.