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INMUNO ENZAYOS ELIZA

ENZIMATICOS
DIRECTO

INDIRECTO
VARIANTES
COMPETITIVO
DEL MÉTODO
DE ELISA
INHIBICION

SANDWICH
ELISA
DIRECTO
• Sencillo y rápido

• Deteccion de antigeno
Elisa
Directo • Uso limitado
– Menor sensibilidad
– Dificultada para obtener un
conjugado que reconoce
directamente al antigeno
enzima anticuerpo
Se ajustan lo Ag a la concentración deseada
y se utilizan para la sensibilización de la
placa/pocillos
En cada pocillo se añade cada uno de los Ag a
estudiar y la placa se incuba en las condiciones
adecuadas para la fijación del Ag a esta
Los Ag que no se unen se eliminan con al
menos 3 lavados de S.S.
Para evitar que en las próximas incubaciones se
unan a la placa de forma inespecífica otras
moléculas no deseadas que puedan interferir en
los resultados, como por ejemplo el propio
conjugado
Como
bloqueador se
leche caseína utiliza una
proteína que no
reaccione con
ninguno de los
reactivos
utilizados en el
ensayo
Se adiciona el conjugado que reconoce de forma
directa al Ag que se busca

enzima

Ac
Durante la incubación el conjugado reconoce
específicamente al Ag
formando inmunocomplejos formados
por los Ag iniciales y el complejo que
quedan fijados en el pocillo
Si los Ag fijados a la placa no son
reconocidos por el conjugado no se
forman estos
Para la detectar la existencia de inmunocomplejos se
utiliza una mezcla con el sustrato de la enzima y un
cromógeno
Durante la
incubación el
sustrato se rompe y
el oxigeno liberado
hace que el
cromógeno se oxide
y cambie de
coloración

Se adiciona H₂SO₄
para detener la
reacción ya que
desnaturaliza a la
enzima y estabiliza
la coloración
LECTURA DE RESULTADOS
ELISA
INDIRECTO
En la placa debe de estar adherido el Ag
que es reconocido por el Ac que se quiere
detectar
La sensibilización de la placa consiste en la
fijación a la misma de los Ag deseados
ajustados a la concentración adecuada
Se rellenan los pocillos con los Ag preparados y
se incuban y posterior mente se lavan con S.S.
Como bloqueador se utiliza una proteína que no reaccione con
ninguno de los reactivos utilizados en el ensayo

1 2

4
3
Para determinar la presencia de los Ac deseados es
necesario tener un suero patron donde se
encuentren estos, se incuban en condiciones
adecuadas y se realizan los respectivos lavados
Si los Ac buscados están en la
muestra se unirán específicamente a
los Ag fijados previamente
enzima
Ac
El conjugado debe ser especifico de algún
epítopo presente en el tipo de inmunoglobulina
que se busca en el suero, estos corresponden a
la parte constante del Ac
Es fundamental elegir el conjugado adecuado y especifico
para la molécula en estudio y para ello hay que tener en
cuenta la especie animal que se está estudiando y el
isotipo de Ac que interesa ya que los Ac tendrán
propiedades antigénicas distintas en cada caso
Se incuban los
pocillos con el
conjugado y se
realizan los
lavados
correspondientes
Tras los lavados
permanecen los Ag
iniciales , los Ac
específicos y el
conjugado
correspondiente, es
decir los
inmunocomplejos
que se han generado

Si en la muestra no
está el Ac solo
quedaran los Ag
iniciales
1
2

3 4
ELISA TIPO
SANDWICH
Ac
monoclonales
conjugado

Inmunocomplej
o
ELISA
COMPETITIVO
RESULTADOS
DEL GRUPO

1 2 3 4 6
WESTERN
BLOT

Foto de TimVickers / CC BY-SA 3.0


Antecedentes

inmunopreci Western
Ouchterlony
pitación blot
Descrita por
• Método analítico mas útiles que se
encuentran para el análisis
Towbin y col. antigénico.

Hoy
1979
• Técnica utilizada para identificar
una proteína en una muestra
¿En que que contiene varias proteínas
consiste?
Las proteínas de la muestra se
separan mediante
electroforesis en gel en función
¿Cómo de su PM
funciona? Se utiliza un Ac especifico para
detectar la proteína de interés
El “R” aporta información
sobre el PM de la proteína.
Material y
reactivos
Protocologo
• Buscar en las notas de diapositiva siguientes temas a tener
en cuenta para hablar

Aplicaciones
R
e
s
u
l
t
a
d
o
s
Enlaces
externos
Trabajos
citados