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Cromatografía

Dra. Alba Yadira Corral Avitia


Fundamentos de cromatografía
• Introducción:

A finales de 1800, el botánico ruso Mikhail Tswett separó


diversos pigmentos vegetales como clorofilas y xantófilas
através de una columna de vidrio rellena con carbonato de
calcio finamente pulverizado.

Las especies separadas aparecían como bandas coloreadas en


la columna, por lo que llamó a la técnica cromatografía (del
griego Chroma que significa color y graphein que significa
escribir.

El tremendo impacto de estos métodos en la ciencia se confirmó


al otorgarse en 1952 el Premio Nobel a A.J.P. Martin y R.L.M.
Synge por sus descubrimientos en este campo.
La cromatografía separa componentes de mezclas
complejas, difícil de hacerlo por otras técnicas.

• Se pueden analizar compuestos orgánicos e inorgánicos,


con pesos moleculares de 2 a aproximadamente 1000
Daltons.

En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se


separa con una fase móvil, que puede ser un gas, un
líquido o un fluido supercrítico.
• Esta fase móvil se hace pasar por una fase
estacionaria que es inmiscible y que se fija a una
columna o a una superficie sólida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los


componentes de la muestra se distribuyen de
diferente manera entre ambas fases.

Aquellos componentes que son fuertemente


retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil y
aquellos que se unen débilmente a la fase
estacionaria, se mueven con rapidez.
Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la
muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden
analizarse cualitativa y cuantitativamente.
• En dos clases (Skoog et al., 2001):

1. De acuerdo a la forma en que las fases móvil y


estacionarias están en contacto.
1.1. Cromatografía en columna
1.2. Cromatografía en placa

2. De acuerdo al tipo de fase estacionaria y móvil


empleadas y en la clase de equilibrios implicados en
la transferencia de los solutos entre las fases.

Skoog D.A., Holler F.J. y Nieman T.A. (2001). Principios de análisis instrumental. MacGraw
Hill Interamericana de España, 1028 p.
Tipos de
Cromatografía
Absorción
Fase Inversa
Capa Fina
Intercambio Iónico
Filtración de gel
Afinidad
Cromatografía de Absorción

• Fase estacionaria sólida Grupos OH  Grupos polares o insaturados


y una fase móvil liquida
Disolvente
o gaseosa. El soluto se débil Disolvente
adsorbe en la superficie fuerte
H

de las partículas sólidas. O R

O
R

O H
H H H
H O
O
O O O
O Si Si
Si Si

Sílice: Ácida  solutos básicos


Alúmina: Básica  solutos ácidos
Mayor retención compuestos polares
Cromatografía de Absorción

• Polaridad del disolvente  k´

Series Índice de
eulotrópicas polaridad, P’ Índice de polaridad
Hexano 0.001; 0.1 mezcla
Diclorometano 0.42 P´AB = x· P´A + x· P´B
Acetato de etilo 0.58; 4.4
2 propanol 0.82 k´2/ k´1 = 10(P2 - P1)/2
Ácido acético 1
Agua 10.2

 Polaridad similar: AcOEt para carbonilo


Cromatografía de Fase Inversa
Grupos alquilo (C-8, C-18) unidos a sílice
Fase estacionaria menos polar que la fase móvil
Compuestos polares eluyen primero

Similitud con extracción líquido líquido


Fuerza del eluyente inversa que en adsorción
Adsorción Fase Inversa

↓ Polaridad ↑ Polaridad

C B A A B C

Tiempo Tiempo

Fase móvil de polaridad media Fase móvil de polaridad media

C B A A B C

Tiempo Tiempo

Polaridad A > B > C


Cromatografía de Fase Inversa

Fuerza motriz: Fuerza del disolvente para


forzar al soluto hacia la capa apolar

Conforme menos polar sea el disolvente


mayor es su efecto
agua disolvente débil
Metanol, acetonitrilo, 1,4-dioxano
Cromatografía de Capa Fina

• Concentraciones de
muestra:0.0001 al 0.1%.
• Detector UV. dM

Factor de Reparto: RF = dR/dM


k´ = (dM - dR)/dR
dR
k´ = (1 - RF)/RF
N = 16(dR/W)2
H = dR/N
Rx = dR/ distancia patrón
Cromatografía de Intercambio Iónico

• Aniones o cationes están unidos covalentemente a la fase estacionaria


sólida (resina). Los iones del soluto de carga opuesta son atraídos a la
fase estacionaria por fuerzas electrostáticas.
Cambiador catiónico fuerte: SO3-
Tipos de resinas: Cambiador catiónico débil: COO-
Cambiador aniónico fuerte: N+(CH3)3
Cambiador aniónico débil: C2H4N(C2H5)2

RSO3-H+ + Cat+  (RSO3-)Cat+ + H+

cte. De equilibrio: K= CS/CM

moléculas polivantes más retenidas


Cromatografía de Filtración en Gel

Peso mayor
Separa las moléculas por
tamaño. Los solutos grandes
pasan mas rápido.

Peso menor

Volumen de retención es
función lineal del log. del PM

VR = a0 + a1•log(PM)
Cromatografía de Filtración en Gel
Aplicaciones
• Separación por tamaños

• Separación monómeros de dímeros

• Estimación del peso molecular


calibración

• Distribución del peso molecular de polímeros

• Determinación de constantes de equilibrio


a partir de la cuantificación de las especies

• Desalado y modificación de la solución tampón


Cromatografía por Afinidad

• La fase estacionaria esta compuesta por moléculas


que están covalentemente unidas (inmovilizadas).
Estas moléculas pueden ser un anticuerpo que será
afín a un determinado tipo de proteínas.
Nomenclatura

• Elución
• Transporte de una especie a través de una columna por la
adición continuada de nueva fase móvil.
• Fase móvil
• Liquido o gas que transporta los analitos a través de una
fase estacionaria sólida o liquida.
• Fase estacionaria
• Sólido o liquido inmovilizado sobre el cual se reparte la
especie de analito durante el paso de una fase móvil.
Nomenclatura

• Coeficiente de distribución
• K= [S]e/[S]m. [S] e concentración molar del soluto en la fase
estacionaria y [S] m es la concentración molar en la fase
móvil.
• Tiempo de retención
• Tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y
la llegada de un pico de analito al detector. Se identifica con
la nominación tR.
• Tiempo muerto
• Tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y
la llegada de un pico de un analito no retenido al detector. Se
identifica con la nominación tM.
Nomenclatura

• Factor de retención
• Termino empleado para describir la migración de una
especie a través de una columna cromatográfica. Su valor
numérico esta dado por k=(tR – tM)/tM. tM es el tiempo
muerto.
• Factor de selectividad
• α, proporciona una medida de que tan bien separa una
columna a dos analitos.
• Altura de plato
• Cantidad que describe la eficiencia de una columna
cromatográfica.
Nomenclatura

• Difusión longitudinal
• Migración de especies en una solución desde una región de
concentración alta hasta una mas diluida.
• Difusión en remolino
• Movimiento del soluto por varios caminos en la columna.
Esta dado por el diámetro de las partículas que componen
el relleno de la columna.
• Resolución de la columna
• Medida de la capacidad de una columna para separar dos
bandas de analito.
Nomenclatura

• Efluyente
• Fase móvil eluída.
• Eluyente
• Fase móvil que transporta solutos a través de una fase
estacionaria.
Absorción Adsorción
(Partición)
Cromatografía de
elución en
columna

•Velocidad media,
depende de la
fracción de tiempo
que el soluto reside
en la fase móvil.

•Dilución del analito.


•Cromatogramas.

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