• Analizar ácidos

fenólicos en Geigeria
Alata (raíces y hojas) y
OBJETIVO evaluar sus actividades
antioxidantes y
antimicrobianos.
 INTRODUCCIÓN

Planta medicinal aromática “ Gud-gad ”

La epilepsia, la neumonía, y el reumatismo , tos y problemas

intestinales

Fuerte actividad inhibidora de la inmunomodulación

Respuesta al estallido oxidativo

El uso tradicional de G.
El tamizaje Fitoquímico
alata tiene el efecto de las partes aéreas
antidiabético de una mostró la presencia de
solución acuosa-metanol alcaloides, flavonoides,
de extracto de raices en taninos, y aceite volátil
ratas diabéticas inducidas (El-Kamali
con estreptozotocina. (Hafizur et y El-Amir,
al., 2012)
2010

Se describieron como (Siquet et al., 2006). (Lin y

Los ácidos fenólicos son
antioxidantes, probablemente Harnly, distribuidos en la naturaleza
actúan a través de la
eliminación de radicales, que 2008) en sus formas libres y
ligadas, como ésteres y
está relacionado con su
glucósidos
capacidad de donación de
hidrógeno.
• En base a todos estos hallazgos,
se investigó el contenido de
ácidos acilquinámicos de las
raíces y hojas de G. alata usando
métodos tanto de cromatografía
líquida de alto rendimiento con
detección ultravioleta (HPLC-UV)
como de cromatografía líquida
con espectrometría de masas
(LC-MS).
En el presente estudio, se evaluó
el potencial antioxidante y la
posible actividad antimicrobiana
de los extractos acuosos de
metanol y de los principales AQC,
aislados de ambas variedades .
 • Se identificó por LC – MS los ácidos fenólicos en la fase extracto acuosa-
metanol. Los compuestos principales se aislaron por cromatografía
METODOLOGÍA: líquida de baja presión.

• El análisis cuantitativo de los ácidos fenólicos se realizó mediante una

HPLC -UV método con límites de detección que van 0,04-0,57 μ g / mL.
METODOLOGÍA:

• Los métodos utilizados para la evaluación de la actividad antioxidante

DPPH) (ABTS) (FRAP)
METODOLOGÍA

• Se determino la concentración mínima inhibitoria y el porcentaje

mínimo de concentración bactericida mínima frente a bacterias y
METODOLOGÍA: hongos patógenos las mismas que se determinaron mediante la prueba
de microdilución en caldo.
 Departamento de
Microbiología
Infecciosas

Departamento de Departamento de
Botánica, Facultad Farmacognosia de
de Ciencias, la Facultad de
Universidad de Farmacia
Jartum, Sudán

Departamento de
Departamento de
Farmacología de
Química Médica y
la farmacoterapia
Bioquímica
y la toxicología
 Reactivos
Químicos Reactivos
Extrasintesis

• El ácido • DPPH • disolventes de grado

protocatequídico • ABTS
• Trolox
• El ácido
neoclorógeno (3- • TPTZ
CQA) • Cloruro férrico x 6 H2o
• El ácido clorogénico • Acetato de sodio
(5-CQA) • Persulfato de potasio
• MTT
• El ácido cafeico
• Sigma-Aldrich
HPLC fueron
proporcionados por
Merck
• Caldo Mueller Hinton (#
M0405B)
• Agar (# CM0337B) de
Thermo Scientific-Oxoid
• Varias cepas bacterianas
positivas y negativas
para fueron utilizadas
para los ensayos de
susceptibilidad.
 EL MATERIAL VEGETAL Y EL AISLAMIENTO DE L0S ÁCIDOS ACILQUINÁMICOS :
G. Alata raíces-hojas (julio de 2011) (Sudán), autenticación Dr. Wail El Sadig Univ. Jartum
Preparación de la muestra para análisis HPLC-UV y LC-MS
3g Extracto 33 mg
acuoso
metanol Los extractos se combinaron y se completaron hasta 5 ml en un
asistida matraz volumétrico. Se analizó (1 ml) del extracto a través de
por un disco de 0,45 μm de polietileno y se sometió a los análisis
ultrasonido 177 mg HPLC-UV LC-MS.

Se fracciono 1g raíces x cromatografía lıquida a baja presión-columna RP C18 (Disolvente A) y

23 g metanol (disolvente B), Las fracciones se concentraron a vacío a 40 ◦ C y se purificaron x
cromatografía repetida para dar :
Ácido 3,5-dicafeoilquınico (10) (22mg)
Ácido 4,5- dicafeoilquınico (11) (15 mg)
Ácido 3,4,5 – tricafeoilquínico (15) (12 mg) 96% pureza al 96 %.
Análisis HPLC-UV
Sistema cromatográfico Varian, bomba terciaria modelo 9012, un inyector de muestra de 10µl y un detector UV modelo 9050
ajustado a 280 nm (1) y 310 nm (para 2,4,5,10,11,15) . Se utilizó un programa informático (versión 4.5) Los análisis de HPLC se
realizaron en una columna inversa de hipersil ODS RP18.
Las sustancias móviles fueron: (A) metanol acuoso al 3%, (B) metanol acuoso al 45% y metanol (C). El caudal era de 1,2 ml / min
y la temperatura del horno se fijó a 35ºC.

Análisis cuantitativo El análisis por HPLC de ácidos fenólicos (1, 2, 4, 5, 10, 11 y 15) Se prepararon soluciones de trabajo que
contenían 0,2, 0,1, 0,05, 0,02 y 0,01 mg / ml de los ácidos fenólicos ensayados a partir de una solución de material en metanol
que contenía 0,5 mg / ml. Se realizaron análisis triplicados para cada concentración y se detectó el área del pico a 280 y 310 nm.

Análisis LC-MS
Espectrómetro híbrido Q Exactive cuadrupolo-Orbitrap masa con ionización electrospray y ( UHPLC sistema)
Cromatografía líquida de alto rendimiento La separación cromatografíca se dio con columna Syncronis® utilizando como eluyentes:
(A) ácido fórmico al 0,1% en agua
(B) ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo
Todos los parámetros de MS se optimizaron utilizando el programa de software XCalibur®
 Análisis Cuantitativo :
El análisis por HPLC de ácidos fenólicos (1, 2, 4, 5, 10, 11 y 15) se realizó utilizando Análisis
cuantitativo o el método estándar externo.

Se prepararon soluciones de trabajo que contenían 0,2, 0,1, 0,05, 0,02 y 0,01 mg / ml de los
ácidos fenólicos ensayados a partir de una solución de material en metanol que contenía 0,5 mg /
ml.
Se realizaron análisis triplicados para cada concentración y se detectó el área del pico a 280 y 310
nm.
Control de calidad :
El rendimiento analítico se calculó de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Internacional
de Armonización (ICH, 2005). Se calcularon los parámetros de calidad, incluyendo los límites de
detección, linealidad, precisión, precisión y recuperación.
En los estudios de repetibilidad, reproducibilidad y recolección, una solución estándar de( 1 )(1,25
μg / mL), 2 (2 μg / mL), 4 (8,75 μg / mL), 5 (6,86 μg / mL), 10,11 y 15 (3,75 μg / mL ) se utilizó.
La sensibilidad del método analítico se determinó de acuerdo con las definiciones de límites de
detección de métodos (MDLs) y límites de cuantificación de métodos (MQLs).
 RESULTADO Y DISCUSIÓN
Análisis LC-MS de extracto G.alata

Figura 1. Cromatogramas LC-MS (A) y HPLC-UV (B) del extracto de raíces de Geigeria alata (las asignaciones de picos se enumeran en la Tabla 1)
Tabla 1.Cuadro de asignación de los extractos de Geigeria alata
Cuantificación de acido fenólicos en extractos de G alata
Cuantificación de Ácido Fenólicos en extractos de G. alata
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO TOTAL DE POLIFENOLES Y FLAVONOIDES

Cuantificación Polifenoles
Reactivo de Folin-Chiocalteu

Cuantificación Flavonoides
Reactivo de Folin-Chiocalteu
Pirogalol como estándar pirogalol como estándar
760 nm Espectrofotómetro Shimadzu UV- 430 nm con Al CL3
1203.

El contenido de derivados de polifenol se El contenido de derivados de Flavonoides

calculó como un porcentaje de pirogalol se calculó como un porcentaje de
equivalente (% PE) para el extracto de peso pyperoxide equivalente (% HE) para el
seco . extracto de peso seco .
Por triplicado Por triplicado
ENSAYOS DE ACTIVIDAD MICROBIANA
La actividad antioxidante se midió utilizando DPPH, ABTS y férrico reducción de la potencia antioxidante (FRAP) métodos con
ligeras modificaciones (ZhelevaDimitrova y Balabanova, 2012).
IC 50 se determinaron los valores (concentración de la muestra donde absorbancia de DPPH y ABTS disminuye 50% con respecto a
la absorbancia del blanco). Resultados para FRAP se expresan INMM Trolox equivalente por gramo de peso de extracto seco (TE / g
DW). El ácido clorogénico (5-CQA) se utilizó como control positivo.
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado ( n = 3).
La actividad antimicrobiana se estimó en microplacas de 96 pocillos mediante el método de microdilución en caldo de acuerdo con
procedimientos clínicos y de laboratorio Standards Institute (CLSI) (CLSI, 2009). Los inóculos bacterianos estandarizados se
prepararon mediante la suspensión de 3 - 4 colonias de un cultivo o / n puro en 4 ml de solución salina. el inóculo ' s turbidez se
ajustó a McFarland 0,5 (10 8 CFU / ml) mediante el uso de un espectrofotómetro ( λ = 600 nm) y 50 μ L se re-suspendió en 10 mL
Mueller - caldo Hinton (MHB).
Los inóculos bacterianos se añadió a las variando desde 0,039 hasta 5 mg / mL. El volumen final de cada muestra fue de 100 μ L /
pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 h. El control negativo se preparó mediante la difusión de 10 μ L de la inoculación-
suspensión en una placa de agar nutriente y se incubaron a 37 ° C durante la noche. Gentamicina y vancomicina fueron utilizados
como antibióticos de referencia para los controles positivos.
Los experimentos se realizaron por triplicado. las concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) se determinaron visualmente como
el más bajo crecimiento visible concentrationwithout y se expresó como miligramos por mililitro. La actividad metabólica de las
cepas bacterianas tratada se estimó por análisis espectrofotométrico y presentado como un porcentaje de control no tratado. Para
se incubaron las últimas tratados y no tratados células bacterianas durante 180 min a 37 ° C con el colorante MTT en una
concentración final de 0,05 mg / mL. cristales de formazán se disolvieron por un volumen equivalente de ácido fórmico al 5% en
isopropanol. La absorción se midió con un lector de ELISA BioTek ELx800 (Winooski, VT, EE.UU.) a 550 nm (referencia 690 nm)
frente a una solución en blanco. concentraciones mínimas bactericidas (MBC) se determinaron mediante la incubación en Mueller -
agar Hinton, de 20 μ L del control no tratado y muestras tratadas con ½MIC, MIC y 2Toma de MIC durante otras 24 h a 37 ° C.
CFDLM se leyeron como concentraciones en las que no hay crecimiento bacteriano se produjo en las placas de agar y se expresaron
como miligramos por mililitro.
Resultados:
Por primera vez, el ácido 3,5-dicafeoilquínico (25,96 ± 2,08 mg / g )
(el ácido 3,5-dicafeoyquinámico, ) Fueron los ácidos fenólico más
abundante en las raíces.

El ácido 4,5-dicafeoylquínico (8,99 ± 0,56 mg / g DW) fue el compuesto

principal presente en las hojas.

El ácido 3,5-dicafeoilquínico demostró una actividad de barrido radical más

fuerte y una potencia reductora en comparación con los extractos crudos y
el ácido 5-cafeoilquínico de control positivo. El ácido 3,4,5-
tricafeoquinámico reveló el mayor potencial antibacteriano frente a las
cepas Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a la penicilina, así
como a S. aureus resistente a la meticilina.
• El Staphylococcus aureus es uno de los más causante de infecciones cutáneas (por
ejemplo, granos, furúnculos, impétigo, abscesos cutáneos, etc.) tanto en la
comunidad como en los centros de salud. En algunos países africanos, hasta el
90% de la población sigue dependiendo exclusivamente de las plantas como
fuente de medicamentos. En este sentido, los resultados de la actividad de las
raíces de G. alata
• Contra Staphylococcus aureus podría ser relevante para la aplicación tópica de
este extracto vegetal en forma de una apropiada fórmula farmacéutica para el
tratamiento lesiones cutáneas infectadas. Sin embargo, se necesitan
investigaciones más detalladas en modelos animales de infecciones de la piel para
estimar la actividad in vivo y la toxicidad del extracto de raíces y del compuesto 15.
Conclusión
El contenido de ácidos cafeoilquínicos de hasta
6,22% en Geigeria alata en las raíces establece
esta especie como una nueva fuente rica en
estas moléculas bioactivas.