EXCLUSION MOLECULAR

• La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una

cromatografía s-l

• Separa moléculas en función de su TAMAÑO.

• La FE es un gel, constituido por partículas esféricas que tienen

POROS de un determinado tamaño.
 Clasificación
• Cromatografía de permeación de gel:
Emplea fases móviles orgánicas no polares, rellenos
hidrofílicos y materiales de relleno semirígidos o rígidos
que pueden resistir presiones muy elevadas.

• Cromatografía por filtración de gel:

Emplea fases móviles acuosas y rellenos hidrofóbicos
materiales de relleno blandos; incapaces de resistir
presiones mayores de 4 atm.
Aplicación en el estudio de biopolímeros.
 CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIOÓN EN GEL

Molec. GRANDES  RÁPIDAS

* Avanzan con mayor velocidad a través de

los espacios intersticiales (con f. móvil)

Molec. PEQUEÑAS  LENTAS

* Son retenidas por las fibras de las

micropartículas y avanzan con menos velocidad
(con f. estacionaria).
PERFIL DE ELUCIÓN
APLICACIÓN grande
MUESTRA pequeña
respuesta del detector
ELUCIÓN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
 Las moléculas se separan por sus diferentes tamaños
al pasar en la columna que contiene partículas
hidratadas de geles porosos

FLUJO
Moléculas grandes excluyen
totalmente y salen de
primero.

Moléculas pequeñas tienen

Gel acceso a todo el volumen
poroso y son las últimas en
eluír

Las moléculas eluyen por

su tamaño decreciente.

Moléculas grandes

Moléculas pequeñas
 Tamaños de Poro
Poros pequeños en los geles
muy entrecruzados excluyen
moléculas de PM mayor o igual 700
Poros grandes excluyen moléculas de
PM mayor o igual 108
A < tamaño de partícula del gel, mayor
es la resolución y más lento el flujo
a través de la columna.
 Material de relleno
• Pueden ser:
– Soporte blando, ej. gel
– Soporte rígido (vidrio, silica)
– Polímero orgánico entrecruzado compatible con FM

• Características de los rellenos:

- estables mecánica y químicamente
- bajo contenido de grupos iónicos
- uniformidad de poro y tamaño

GEL: red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al

azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son
polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas
poliméricas se entrecruzan hasta formar una red
tridimensional
 Tipos de Geles
• Agarosa (sepharose, Bio-gel A)
sephacryl
Dextranos: (polímero ramificado
de glucosa, entrecruzado) se
comercializa con el nombre de
SEPHADEX

Bio-Gel P (Poliacrilamida
entrecruzada con
-N'-metilenbisacrilamida)

La FE consiste en largos
polímeros entrecruzados
que forman una red
tridimensional porosa
 Tipos de Geles
• Sephadex: partículas pequeñas de dextrano formadas por
una red tridimensional de cadenas de polisacáridos
ramificados.
• Altamente polar debido a su alto contenido de grupos
hidroxilos (hinchan cuando se coloca en agua)
• Se forman por entrecruzamiento de dextrano con
Hepicloridina.

CH2 CH CH 2 Cl
O
Los geles según el tamaño de poro, proporcionan límites de exclusión
comprendidos entre 700 y 200000 daltons.
Estos geles se identifican por una denominación de G-10 a G-200, lo que
se refiere a la capacidad de retención de agua del gel multiplicada por 10.
 Propiedades de los geles

 De preferencia hidrofóbicos
 Partículas con diámetros de 5 a 10 mu
 Tamaño de poro se controla por el grado
de entrecruzamiento entre cadenas
poliméricas (cantidad relativa de
divinilbenceno)
 Poseer límite de exclusión PM = 700 a 1016.
 APLICACIONES
• Separación de sustancias de distintos PM o para purificar
proteínas, se emplea para la determinación de pesos
moleculares de proteínas.
• Para los geles se ha comprobado que existe una relación lineal
entre el volumen de elución y el logaritmo PM de las proteínas.
• Al medir el volumen de elución de una proteína desconocida
en una recta de calibración (preparada con proteínas puras de
PM conocido) se determina PM
• Vo, se mide haciendo pasar
una molécula inerte
grande a través de la
columna.

• Para este fin la molécula

más utilizada es el azul de
dextrano 2000, colorante
PM 2 x 106
Intervalo de fraccionamiento de un gel: Valores extremos
(máximo y mínimo) de PM entre los cuales el gel separa.
Volumen de elución: volumen necesario para eluir un compuesto
Volumen de exclusión de la columna: volumen al que eluyen las
moléculas de tamaño superior al intervalo de fraccionamiento
del gel.
 Ventajas CEM
- No existen interacciones físicas o químicas
entre el analito y FE
• Tiempos de separación cortos y definidos
[todos los solutos salen de la columna entre
Vo y (Vo + Vi).
• Bandas estrechas (buena sensibilidad)
• No hay pérdida de muestra y no se desactiva
la columna (los solutos no interaccionan con
FE)
• Es una técnica reproducible y rápida.
 Desventajas de CEM
• Número limitado de bandas en el
cromatograma debido a que la escala de
tiempos es corta
• No es aplicable a muestras de componentes
de tamaño semejante, como las mezclas de
isómeros.
• Para que la resolución sea aceptable se
necesita una diferencia al menos un 10% en
los PM
• Baja eficacia
Ejemplos de Separación
Determinación del peso molecular