CROMATOGRAFA

Mikhail Tswett, 1906

Separacin de pigmentos vegetales usando una
columna de carbonato clcico
CROMATOGRAFA

Separacin de los componentes

de una mezcla (muestra),
disueltos en una fase mvil a
medida que se van desplazando
con diferente velocidad a travs
de una fase estacionaria
 TIPOS DE CROMATOGRAFAS

ESTADO FSICO DE LAS FASES:

Fase Mvil
- Gaseosa (Cromatografa de gases)
- Lquida (Cromatografa Lquida)

Fase Estacionaria
- Lquida (inmovilizada, soporte)
- Slida
 TIPOS DE CROMATOGRAFAS

CRITERIOS DE SEPARACIN:

1. REPARTO (F. estacionaria lquida)

Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases mvil
y estacionaria en funcin de sus caractersticas. La composicin
de la fase mvil es constante.

2. ADSORCIN (F. estacionaria slida)

Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la
superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la
composicin de la fase mvil para eluirlos.
 CROMATOGRAFA DE REPARTO

1.SOLUBILIDAD
Fase Normal: F. Estacionaria polar, F. Mvil apolar

Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Mvil polar

2. TAMAO (exclusin molecular)

Fases mvil y estacionaria lquidas idnticas
separadas por una especie de tamiz o malla
 CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

1. INTERCAMBIO INICO
Fase estacionaria positiva: Intercambio aninico
Fase estacionaria negativa: Intercambio catinico

2. INTERACCIN HIDROFBICA
Fase estacionaria hidrofbica

3. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD BIOLGICA

Fase estacionaria con ligandos inmovilizados

4. ADSORCIN INESPECFICA
hidroxiapatita, colorantes inmovilizados
 TIPOS DE CROMATOGRAFA
Tipo de Tipo de cromatografa
interaccin/reparto
Reparto Solubilidad Fase Normal
Fase Reversa
Tamao Exclusin Molecular

Interaccin Electrosttica Intercambio aninico

Intercambio catinico
Hidrofbica

Afinidad biolgica Ligandos inmovilizados

Inmunoafinidad
Afinidad inespecfica Hidroxiapatita
Colorantes
 FORMATO

1. COLUMNA 2. BATCH o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS

- Sistemas manuales - Papel
- Equipos automatizados - Capa fina
(HPLC) (TLC, thin layer chromatography)
 TERMINOLOGA

FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatogrfico)

componente esttico de la cromatografa

FASE MVIL: (eluyente) solvente que arrastra a travs de la

columna los componentes de la mezcla a analizar

ELUCIN: paso de fase mvil a travs de una columna hasta

lograr la salida de los solutos

ELUIDO: fase mvil que se recoge a la salida de una columna

 TERMINOLOGA
CROMATOGRAMA: Perfil cromatogrfico, Perfil de elucin.
Representacin grfica de la cuantificacin de solutos en el
eludo de una columna

VOLUMEN DE ELUCIN: volumen de fase mvil que pasa a

travs de la columna hasta que sale cada soluto

VOLUMEN MUERTO: volumen de elucin de una molcula que

viaja a travs de la columna con la velocidad de la fase mvil,
que no experimenta ningn retraso. Tambin se llama
VOLUMEN DE EXCLUSIN
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Registrador
Solventes
(fase mvil)

Bomba(s)

COLUMNA
Detector
(UV)
Mezclador

Inyector
Colector de
fracciones
 HPLC:
High Performance Liquid Chromatography
Waters, Millipore
Perceptive BioSystems, BioCAD
SEPARACIN DE AMINOCIDOS
MEDIANTE HPLC
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
(manual)
SEPARACIN DE COMPONENTES CELULARES
POR ULTRACENTRIFUGACIN
ELIMINACIN DE MOLCULAS PEQUEAS
MEDIANTE DILISIS
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR
 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Volumen de lquido
2.0
en los intersticios (Vo)

Absorbancia (280 nm)

Volumen de lquido
en las partculas (Vi)
Volumen ocupado
por la matriz (Vg)

VT = Vo+ Vi + Vg
Volumen total 0.0
20 40 60 80 100 120
de lquido (Vt)
Volumen de elucin (ml)

Flujo isocrtico, condiciones nativas o desnaturalizantes

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamao

Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000

Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000
Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000

Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000

Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000
Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000

Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000

Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000
Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000
 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR:
Estimacin de masas moleculares
Marcadores de masa molecular
2.0 25 kD Recta de calibrado
67 kD 14 kD
A280 nm

43 kD

Volumen de elucin (ml)

0.0
20 40 60 80 100 120

2.0
Protena problema
A280 nm

0.0 Log Mr
20 40 60 80 100 120
Volumen de elucin (ml)
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

VENTAJAS:
Flexibilidad en cuanto a solvente
Condiciones poco agresivas
Proporciona informacin estructural

INCONVENIENTES:
Poco resolutiva, debido a difusin
La muestra se diluye
Es necesario aplicar volmenes muy pequeos

Etapas finales de protocolos de purificacin

 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR:
Columnas de desalado

2.0
0.3 kD
120 kD

0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.2

Volumen de elucin (ml)

Cambio de solvente
Purificacin de fragmentos de DNA marcados
(fragmento 200 pb: 120 kD; nucletidos libres: aprox. 0.3 kD
INTERCAMBIO INICO
 INTERCAMBIADORES INICOS

FASE ESTACIONARIA: SOPORTE GRUPO CARGADO

SOPORTES:

RESINAS SINTTICAS. (P.ej. Poliestireno)

- Densidad muy alta de grupos
intercambiadores
- Muy hidrofbicas: desnaturalizacin
de biomolculas
- Eliminacin de impurezas inicas de
solventes qumicos y de tampones
Purificacin de agua

POLMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

INTERCAMBIADORES INICOS
 INTERCAMBIADORES INICOS
Intercambiador Tipo Grupo cargado Abreviatura

CH2CH3
+
Fuerte -CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3 QAE
CH2CH3
De aniones Dietil-2-hidroxipropilamino etilo
CH2CH3
+
Dbil -CH2CH2-N-H DEAE
CH2CH3
Dietilamino etilo

Fuerte -CH2CH2-CH2-SO3
-
SP
Sulfo propilo
De cationes -
Dbil -CH2-COO3 CM
Carboxi metilo
 INTERCAMBIADORES INICOS

+
carga aninico aninico
dbil fuerte
(DEAE) (QAE)

pH
catinico catinico
fuerte dbil
(SP) (CM)
-
 INTERCAMBIO INICO

Matriz(-). In(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + In(+)

[Matriz(-) . Soluto(+)] [In(+)]

K=
[Matriz(-) . In(+)] [Soluto(+)]
 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

1. Equilibrado. Ajuste a
condiciones iniciales
+
2. Adsorcin. Baja fuerza inica.
Intercambio aninico, pH >pI
Intercambio catinico, pH < pI
3. Lavado. Condiciones iguales a pH
la adsorcin. pI
4. Elucin. Modificacin de la -
fase mvil: aumento de fuerza
inica
 INTERCAMBIO INICO
GRADIENTE DISCONTINUO
0.5
2.0
Absorbancia (280 nm)

[NaCl]
(M)
----

0.0 0.0

20 40 60 80 100 120

Nmero de fraccin
 INTERCAMBIO INICO
GRADIENTE LINEAL
0.5
2.0
Absorbancia (280 nm)

[NaCl]
(M)
----

0.0 0.0

20 40 60 80 100 120

Nmero de fraccin
 CROMATOGRAFA DE INTERACCIN HIDROFBICA

2.0 1.0

Absorbancia (280 nm)

[Sal]
(M)
- - --

0.0 0.0
20 40 60 80 100 120
Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Nmero de fraccin
CROMATOGRAFA DE INTERACCIN HIDROFBICA

Capacidad de facilitar interacciones hidrofbicas

(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN-

(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

 FORMATO

1. COLUMNA 2. BATCH o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS

- Sistemas manuales - Papel
- Equipos automatizados - Capa fina
(HPLC) (TLC, thin layer chromatography)
 CROMATOGRAFA SOBRE SUPERFICIES PLANAS

- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer chromatography)
 CROMATOGRAFA EN PAPEL

- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras

de celulosa del papel

- Fase mvil: Solvente orgnico (mezcla)

Cromatografa de reparto, fase normal

 CROMATOGRAFA EN PAPEL

Aplicacin de la muestra: volumen mnimo

Desarrollo de la cromatografa: Extremo sumergido

en la fase mvil, sin tocar el punto de aplicacin de la muestra.
Recipiente cerrado hermticamente. Ascendente/descendente

Deteccin de las sustancias separadas:

Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)
Tincin
Autorradiografa (compuestos radiactivos)
 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Optimizacin de cromatografa en papel

Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de slido

pulverizado sobre una superficie de vidrio, plstico o cristal.

Celulosa, poliamida, almina, slica-gel

 VENTAJAS DE LA TLC
Caracterstica Efecto Ventaja

Elevada accin capilar Rapidez de desarrollo

Fase estacionaria
finamente dividida
Elevada superficie de
contacto f. mvil f.
estacionaria Eficiencia
cromatogrfica
Ausencia de Reducida dispersin de los
estructura fibrosa solutos durante aplicacin y
desarrollo Sensibilidad

Vlida cualquier fase Versatilidad

estacionaria que pueda ser
pulverizada
 MTODOS DE TINCIN EN TLC
Mtodo Aplicacin Color
Inespecfico Vapores de Iodo C. orgnicos Pardo-amarillento

H2SO4 + calor C. orgnicos Negro (carbonizacin)

Especfico 2,4- C. carbonlicos Naranja

dinitrofenilhidracina
AgNO3/OH- C. carbonlicos Marrn

cido iodoplatnico Bases Prpura-negro

Verde de cidos Verde-amarillento

bromocresol
Ninhidrina Aminas 1rias Azul-violceo
(aminocidos)
Rodamina 6G Lpidos fluorescencia
 FACTOR DE RETARDO (Rf)

Frente del
solvente

soluto

Distancia migrada por el soluto

Rf =
Distancia migrada por el frente

origen
 TLC BIDIMENSIONAL

2 dimensin
1 dimensin

punto de
aplicacin
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

+ glucose
 CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

2.0
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones
iniciales.

Absorbancia (280 nm)

2. Adsorcin. Alta fuerza inica.
Adicin de
ligando libre
3. Lavado. Condiciones iguales a la
adsorcin.

4. Elucin.
Competicin con ligando libre
Desnaturalizacin (pH,
temperatura, agentes caotrpicos)
0.0
20 40 60 80 100
Nmero de fraccin
LIGANDOS PARA CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

Ligando Aplicacin
2,5-ADP Deshidrogenasas dependientes de NADP+

5-AMP Deshidrogenasas dependientes de NAD+

Arginina Sern-proteasas
Benzamidina Sern-proteasas
Calmodulina Quinasa, protenas dependientes de calmodulina

Concanavalina A (ConA) Glicoprotenas, polisacridos

ADN ADN y ARN polimerasas
Gelatina Fibronectina
Heparina Factores de coagulacin, lipoprotenas, enzimas
especficas de ADN y ARN
Lectinas Glicoprotenas, polisacridos
Lisina Plasmingeno, ARNr
Protena A Anticuerpos (IgG)
Protena G Anticuerpos (IgG)
Poli-(U), Poli-(T) Poli-(A), ARNm
Poli-(A) Poli-(U)
 CROMATOGRAFA DE AFINIDAD:
PREPARACIN DE LA FASE ESTACIONARIA

1. Activacin del soporte

2. Anclaje covalente del ligando
3. Bloqueo de grupos reactivos remanentes

NH

=
OH O + NH2-ligando O-C-NH-ligando
agarosa

agarosa
agarosa

+ CNBr
C=N
OH O OH
PROTENAS DE FUSIN RECOMBINANTES
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
INMUNOPRECIPITACIN
INMUNOPRECIPITACIN