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blot
Northern blot es una tcnica de laboratorio que se utiliza para
detectar una secuencia de ARN especfica en un muestra de sangre
o de tejido.
AUTORRADIOGRAFA
Se aaden sondas radioactivas de cidos nucleicos (con
secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se
coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa
fotogrfica y se revela (B).
1. Aislamiento de RNA
2. Desnaturalizar el RNA
3. Separar por electroforesis desnaturalizante
4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon
5. Hibridar con sonda especfica
6. Revelar con placa de Rayos X pantalla de fosforimager
Expresin
a) NITROCELULOSA
o Baja capacidad de union de acidos nucleicos(80microgramos/cc2)
o Fragil
o Carga negativa
b) NYLON
o Mayor capacidad de unin (400-500microgramos/cc2)
o Mayor resistencia
o Carga neutra o positiva
El procedimiento general comienza con la extraccin del RNA total de una muestra de tejido
homogenizado
Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel
Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las
muestras de RNA, separadas por tamao tras la electroforesis, sern trasferidas a una
membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vaco.
Los sistemas de capilaridad inica se utilizan para transferir el RNA desde un gel de
electroforesis a una membrana de Northern blot.
Despus del marcaje de la sonda, esta se hibrida con el RNA en la membrana
Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma
especfica y para evitar ruido de fondo en las seales emitidas por la misma
Permite observar la expresin gentica de tejidos, rganos, niveles de
estrs ambiental e infecciones causadas por patgenos.
Sobrexpresin de oncogenes y la desregulacin de genes
oncosupresores en clulas cancerosas.
Nos indica si existe algn tipo de delecin en el proceso de
transcripcin .
Con la alteracin de la sonda podemos conocer la secuencia e incluso
determinar que regin del RNA ha sido delecionada
Ventajas
La muestra de RNA requiere un mnimo de procedimiento
La tcnica puede ser fcilmente evaluada (degradacin, lmite de deteccin).
Nos permite reconocer el anlisis de mutaciones y alteraciones de RNAm de enzimas, y el la regulacin de la
expresin gnica de marcadores moleculares de clulas leucmicas humanas y molculas del reconocimiento
inmunolgico
Desventajas
El costo elevado de su elaboracin
La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha resuelto parcialmente
haciendo mediciones por duplicado
Su resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades qumicas de esta.
Se requiere mucha mas de RNA(20microgramos de RNA total ).
1. http://www.ehu.eus/biomoleculas/isotopos/blot.htm
2. https://www.genome.gov/glossarys/index.cfm?id=458
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4287216/