Captulo 2

Catlise Heterognea

2.11. Catlise Enzimtica

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2.11. CATLISE ENZIMTICA
2.11.1. NOTA INTRODUTRIA
A catlise enzimtica faz parte do grupo de reaces bioqumicas (ou
microbiolgicas) e envolve enzimas (protenas = polmeros de aminocidos)
produzidas por clulas vivas.
Todas as enzimas so protenas, mas nem todas as protenas so enzimas
Enzimas aparecem muitas vezes no estado coloidal e so muito especficas
na sua actividade cataltica: agem sobre um conjunto muito restrito de
molculas (substratos).

Em catlise enzimtica:
Local activo enzima
Actividade cataltica actividade enzimtica

Designaes:
- Enzima (E): Protena com propriedades catalticas
- Substrato (S): Reagente (substncia que quimicamente transformada a
uma velocidade acelerada pela aco da enzima) 2
 As enzimas so de longe os catalisadores mais eficientes, pois
regulam a maioria das reaces biolgicas.

Catalisadores biolgicos so inquestionavelmente os catalisadores

mais importantes porque sem eles, a vida seria impossvel.

Enzimas so protenas que podem ser tanto molculas isoladas em

soluo (homognea) ou molculas ligadas a macromolculas ou a
paredes de clulas (heterogneas).

O Homem ainda no aprendeu a criar (ou preparar) catalisadores com

a eficincia e selectividade nem prxima dos catalisadores
enzimticos naturais.

Os reactores biolgicos so os mais eficientes possveis.

A catalise enzimatica homognea pois o substrato, a enzima e os

produtos esto todos na fase aquosa.

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Principais caractersticas dos processos microbiolgicos que
contrastam com as de um processo qumico ordinrio:
O meio reacional invariavelmente aquoso;
Os produtos aparecem em baixas concentraes (muito raramente acima
de 5 10% para agentes qumicos e muito menos para enzimas);
Temperaturas de reaco baixas, normalmente na faixa dos 10 60C; o
ptimo para alguns casos pode ser na ordem dos 5C ou menos;
O processo requer valores de pH moderados (4 a 9) e em estreitas
bandas de variao;
Geralmente, a escala dos processos comerciais (com pequenas
excepes) modesta e no que toca s enzimas muito pequena,
apenas poucos kg/dia;
A massa dos microorganismos aumenta simultneamente com a produo
dos produtos qumicos;
Ractores BATCH so os mais usados, embora existam poucos processos
contnuos em escala maior;
O ar deve ser esterilizado para evitar contaminao durante o processo
operatrio.
4
 O princpio da enzima
reduzir a energia de
activao da reaco

A enzima caracterizada pela sua:

Actividade;
Versatilidade ( funo cataltica multifacetada);
Especificidade ( funcionalidade apenas em determinadas condies)

As principais especificidades das enzimas so:

Especificidade absoluta - a enzima s pode exercer aco cataltica sobre
um determinado substrato.
Especificidade de grupo est relacionada com o facto de a enzima s
exercer a sua actividade sobre substratos de um grupo funcional especfico.
Especificidade reactiva corresponde ao facto de a enzima actuar sobre
substratos que formam uma determinada ligao qumica.
Especificidade geomtrica prev que a enzima actuar sobre substratos
com uma dada configurao geomtrica. 5
Nomenclatura:
As enzimas so nomeados de acordo com o tipo de reaces que
catalisam. Normalmente adiciona-se o sufixo -ase ao nome do
substrato sobre o qual a enzima actua.

Exemplos:
- Urease enzima que catalisa a decomposio da ureia
- Tyrosinase enzima que catalisa a reaco da tyrosina
- Glucose oxidase enzima que catalisa a oxidao da glucose

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2.11.2. MECANISMO DA ACO ENZIMTICA
Modelo de Fischer (chave-fechadura)
Baseado no facto de as enzimas serem dotadas de especificidade Emil Fischer
props um modelo de actuao em que o substrato encaixa perfeitamente no
centro activo da enzima tal como uma chave numa fechadura. De acordo com
este modelo, a enzima uma estrutura rgida, tal como o centro activo.

Enzima + uma molcula de substrato (regio especfica: stio de ligao).

Figura. Modelo de Fischer (fechadura-chave), proposto por Emil Fischer em 1894

7
 Modelo de Koshland (encaixe induzido)
Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformao para o encaixe. A
enzima no aceita simplesmente o substrato, o substrato distorcido para
conformao exacta do estado de transio, denominado encaixe por induo.

Figura. Modelo de Koshland (ajuste induzido), proposto por Koshland em 1958

Ao completar a reaco cataltica a enzima liberta o produto e retorna a forma

original. O processo ocorre em duas etapas:
(1) E + S = E.S (etapa reversvel) E.S: complexo enzima-substrato
(2) E.S P + E (etapa irreversvel) 8
Existem trs reaces de enzimas (combinaes E.S) possveis:
Enzima solvel Substrato insolvel
Enzima insolvel Substrato solvel
Enzima solvel Substrato solvel

As equaes da catlise enzimtica so

semelhantes
s dos processos heterogneos.

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2.11.3. HIPTESE DO ESTADO PSEUDO-ESTACIONRIO
(PSSH) OU PRINCPIO DE BODENSTEIN
Condio necessria para a ocorrncia de uma reaco:
Formao de um complexo activado (atravs da reaco
entre o substrato e a enzima, E.S).

Exemplo: Decomposio da ureia sob aco da urease

1. A enzima urease reage com o substrato ureia e forma o complexo enzima

substrato (E.S): complexo
k activado
NH2CONH2 + urease
1
[NH2CONH2-urease]*

2. Este complexo pode decompr-se (reaco inversa) em ureia e urease:

k2
[NH2CONH2-urease]* NH2CONH2 + urease

10
3. Ou pode reagir com H2O formando NH3 e CO2 e regenerando a urease:
k3
[NH2CONH2-urease]* + H2O 2NH3 + CO2 + urease

Usando os smbolos E, S, W, P para Enzima, Substrato, gua e Produtos:

k1
E+S E.S
k2
E.S E+S
k3
E.S + W P+E

Note: A enzima no consumida pela reaco

11
 Velocidade de formao/consumo do
substrato:
rS k1CECS k2CES (A)

Velocidade global da formao do complexo enzima-substrato:

rES k1CECS k2CES k3CWCES

possvel medir a concentrao total das enzimas, mas o mesmo j no
se verifica em relao ao complexo activado

Razo: O complexo activado instvel e de durao efmera

Soluco: Hiptese do estado pseudo-estacionrio, ou princpio
de Bodenstein

1913: Chapman introduziu e Bodenstein desenvolveu a aproximao: em

reaes de cadeia, a taxa de mudana dos intermedirios desprezvel.

12
Este princpio fundamenta-se nos seguintes 2 pontos:
1. O complexo activado existe em muitssimo baixas concentraes;
2. O tempo de vida do complexo activado praticamente,
aproximadamente igual a zero, ou seja, a velocidade de formao
do complexo igual velocidade do seu desaparecimento.

Implicaes no caso da decomposio da ureia:

(B)

A velocidade global da formao do

complexo enzima-substrato igual a zero.

Com base nestes pontos possvel determinar a concentrao dos

complexos activados. Continuemos com o caso da decomposio da
ureia:

A concentrao total dos enzimas, CtE , constante...:

CtE CE CE.S 13
Explicitando CE,
CE CtE CE.S (C)

Substituindo (C) na equao (B), i., aplicando a hiptese do estado

pseudo-estacionrio para os complexos enzimticos:

(D)

Determine CE.S !
k1CtECS
CE.S (E) CE.S expresso em termos de
k1CS k2 k3CW variveis comensurveis

Voltando equao de velocidade de consumo do substrato S (A) e,

subsituindo (C):
rS k1 CtE CE.S CS k2CES (F)

Subtraindo a equao (D) de (F) ou substituindo (E) em (F)

rS k3CWCES (G)
14
Substituindo a expresso de CE.S (E) em (G):

k k C CtECS
rS VS
k1k3CWCtECS
r V
S S
1 3 W
k1CS k2 k3CW (H)
k C k k3CW
1 S 2

Forma final de equao de velocidade

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2.11.4. EQUAO DE MICHAELIS-MENTEN
equao de partida para o projecto de um reactor
enzimtico (ou para o estudo de uma reaco enzimtica)

Como modelo para a deduo da equao de Michaelis-Menten, tomemos

reaco de hidrlise da ureia sob aco da urease,
NH2CONH2 + H2O + E = 2NH3 + CO2 + E
(S + W + E = P + E)

Cuja equao de velocidade (H) j foi deduzida, rS k1k3CWCtECS

k1CS k2 k3CW

A decomposio da gua est CW

ureia levada a cabo em excesso considerada
em soluo aquosa constante

k '3 k 2
Assim, seja: k '
3 k 3 CW e Km
k1 16
 Dividindo o numerador e denominador da equao (H) por k1, obtemos a forma
da Equao de Michaelis-Menten:
k'3CtECS
rS
CS K m
Tomemos: Vmax k '3C tE

VmaxCS
rS (I)
CS K m

Equao de Michaelis-Menten
Onde:
Vmax e Km so os parmetros de Michaelis-Menten
Vmx: representa o valor mximo da velocidade da reaco para um dado enzima
Km: constante de Michaelis-Menten

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Determinao de Km e Vmax

Partindo do traado de VS = f(CS)

Vmax

-rS

0
Km CS

Vmax
VS CS K m
2
Traado da equao de Michaelis-Menten

Porm, este no o mtodo mais rigoroso.

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O mtodo mais rigiroso consiste em linearizar a equao de Michaelis-
Menten, funo VS = f(CS). Existem 3 alternativas:

Vmax CS 1 1 K 1
1. VS m
CS K m VS Vmax Vmax CS

Vmax CS CS K 1
2. VS m CS
CS K m VS Vmax Vmax

3. VS Vmax CS VSCS VSK m VmaxCS

CS K m

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Exemplo de clculo 2.12
Pretende-se converter 80% de ureia em NH3 e CO2 num reactor batch de
volume = 500 ml. A concentrao inicial da ureia de 0,1 mol/l e a da
urease 0.001 g/l. Laboratorialmente, e com uma concentrao total de
enzimas de 5 g/l, obtiveram-se os resultados apresentados na tabela
seguinte:

Cureia 0.2 0.02 0.01 0.005 0.002

(-rureia), mol/l.s 1.08 0.55 0.38 0.2 0.09

Determine o tempo necessrio para se obter a converso desejada

no reactor.

20
2.11.5. MECANISMO DE INIBIO ENZIMTICA
- semelhante ao da desactivao de um catalisador normal

Formas de inibio
(i) Inibio competitiva caracterizada pelo aparecimento de um
substrato inibidor (I) que forma complexos com a enzima, inibindo
(impedindo) a ocorrncia da reaco principal.
Exemplo:
E + S = E.S
E + I = E.I
E.S P + E

Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima

que se liga para realizar a catlise, ela poder aceitar esta molcula no
seu local de ligao, mas no pode levar ao processo cataltico, pois
ocupando o stio activo do substrato correcto. Portanto o inibidor
compete pelo mesmo local do substrato.
O efeito da reaco modifica o Km, mas no altera a velocidade.
21
(ii) Inibio incompetitiva o inibidor forma um complexo com o
complexo formado entre a enzima e o substrato, isto , o inibidor age
no sobre a enzima em si, mas sobre o complexo E.S.
Exemplo:
E + S = E.S
E.S + I = E.I.S
E.S P + E

(iii) Inibio no competitiva (ou no paralela) ocorre quando a

enzima tem locais activos onde preferencialmente se forma o complexo
E +S = E.S e outros locais activos onde preferencialmente se forma o
complexo E + I = E.I e d-se ento a combinao,
E.I + S = E.I.S
E.S + I = E.I.S
portanto, uma combinao entre as inibies competitiva e incompetitiva.

22
 Ocorre quando um molcula ou io pode se ligar em
Exemplo: um segundo local na superfcie enzimtica (no no
E + S = E.S stio activo). Isto pode distorcer a enzima tornando o
E + I = E.I processo cataltico ineficiente.
E.I + S = E.I.S
E.S + I = E.I.S
E.S P + E

O inibidor no competitivo pode

ser uma molcula que no se
assemelha ao substrato, mas
apresenta uma grande afinidade
com a enzima.

o mecanismo inverso do
inibidor competitivo, porque
inibe a ligao do complexo ES e
no da enzima livre. 23
 Esquematicamente

E + S = E.S
E + I = E.I
E.I + S = E.I.S
E.S + I = E.I.S
E.S P + E

Objectivo seguinte:
- Deduzir as equaes de velocidade para as reaes de inibio enzimtica
24
Equaes de velocidade:

I) Para inibio competitiva:

Vmax CS
r S rp VS
C
CS k m 1 I
KI

II) Para inibio incompetitiva:

Vmax CS
r S rp VS
C
CS 1 I k m
KI

III) Para inibio no competitiva:

Vmax CS
r S rp VS
CI
CS km 1 K
I

25
Dedues:
Apartir dos mecanismos de cada forma de inibio, deduza as expresses
acima:

I) Para inibio competitiva:

II) Para inibio incompetitiva:

III) Para inibio no competitiva:

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2.11.6. CATLISE ENZIMTICA COMPLEXA
As reaes enzimticas so complexas. Tal deve-se ao facto de nas
reaces bioqumicas ter-se vrios substratos e produtos que
interactuam entre si.

Casos de catlise enzimtica complexa:

a) Fenmeno da regenerao da enzima

Resulta do facto de em certas reaes enzimticas a enzima aparecer no
fim do processo na forma de complexo com um substrato secundrio (S1)

E.S P + E.S1

O catalisador regenerado (complexo)

no poder exercer a sua funo.

Torna-se necessria a adio de um novo

substrato que origine a regenerao da enzima
27
Exemplo: Oxidao da glicose (Enzima: Glico-oxidase)

Glicose + O2 -Lactona + H2O2

G + O2 -L + H2O2

Designemos: Glico-oxidase: GO (=E1); Glicose: S1 e Oxignio: S2

E1
A reaco: S1 + S2 P1 + P2

Mecanismo da reaco:
S1 + E1 = E1.S1
E1.S1 = P1.E1.H2
P1.E1.H2 P1 + E1.H2
E1.H2 + O2 E1 + H2O2

NB: E1.H2 (= E2) um complexo e no uma enzima

28
Portanto,
S1 + E1 = E1.S1
E1.S1 = P1.E2* Indica que E2 no enzima na sua
forma natural, mas sim um complexo
P1.E2* P1 + E2*
E2* + S2 P2 + E1

Esquematicamente:
S1 E1 P2

P1 E2 S2
29
b) Existncia de co-factores ou co-enzimas
Determinadas enzimas, na sua funo cataltica, no tem hiptese de
transformar o substrato devido forma como se encontram na sua
natureza. Elas podem apenas exercer a sua funo se existir um
composto adicional que forme um complexo com a referida enzima, que
possui actividade cataltica. A esse composto adicional (substrato)
designa-se co-factor ou co-enzima.
enzima

E1 + S1 = E1.S1
co-factor

sem actividade cataltica

E1.S1 + S2 P1 + E1

substrato verdadeiro

30
Entretanto, o segundo passo consiste de 2 subpassos:
E1.S1 + S2 = E1.S1.S2
E1.S1.S2 P1 + E1.S1*

Na maioria dos casos, o substrato (co-factor) S1, sofre uma transformao, de

tal modo que o S1 combinado com E1 j no o mesmo, obtm-se E1.S1*

O composto E1.S1* no possui actividade cataltica, dever sofrer uma nova

transformao de modo a libertar o E1 para reiniciar o ciclo da combinao
com S1 e catlise:
E1.S1* E1 + S1*

Durante o processo reacional, S1 diminui e atinge-se um ponto onde a reaco

pra por insuficincia de S1.

Se S1 for barato e estiver disponvel, pode repr-se a quantidade necessria.

O ideal transformar o S1* em S1 ou E1.S1* em E1.S1.

E1.S1: Holo-enzima
E1.S1*: Apo-enzima
31
 Esquematicamente, segundo a representao dos bioqumicos:

E1
S2 S1

S1*
P1

Nos casos em que S1 um substrato de valor

econmico, necessrio transformar S1* em S1.

Idealmente seria ptimo E1.S1* E1.S1, mas

nos casos em que no seja possvel S1* S1 vlido.
32
Como se processa ento?

b1) Sistemas com substratos mltiplos

Introduz-se um novo substrato (3) no meio reacional que interactua
com E1.S1* de modo a regenerar E1S1, portanto:
E1 + S1 = E1.S1
E1.S1 + S2 P1 + E1.S1*
(E1.S1* E1 + S1*)
E1.S1* + S3 P2 + E1.S1
(E1.S1 = E1 + S1)

Convm que P2 seja de interesse, por isso escolhe-se um substrato

S3 adequado para tal, ou, melhor ainda se P2 = P1.

33
Esquematicamente:

E1
S2 S1 P2

P1 S1* S3
E1

34
Ou, eliminando as reaces entre parnteses:

E1 + S1

S2 E1S1 P2

P1 E1S1* S3

E1 + S1*
35
b2) Sistemas com enzimas mltiplas
Neste caso, introduz-se no um terceiro substrato para reagir com a apo-
enzima (E1S1*), mas sim uma segunda enzima.
E1 + S1 = E1.S1
E1.S1 + S2 P1 + E1.S1*
E1.S1* E1 + S1*
E2 + S1* = E2.S1*
E2.S1* + S2 P2 + E2.S1
E2.S1 = E2 + S1
Esquematicamente:
E1
S2 S1 P2

P1 S1* S2
E2 36
Exerccios
Exemplo de clculo 2.13.
Investigou-se o efeito do pH na constante de Michaelis-Menten (Km) da
enzima 6-fosfogluconato desidrogenase. Utilizando tampes de pH a pH = 7.6 e
pH = 9.0 mantendo constante a concentrao total da enzima, a actividade da
desidrogenase foi medida espectrofotometricamente seguindo a reduo do
fosfato de nicotinamida adenina dinucleotideo ao comprimento de onda de 340
nm. As velocidades iniciais, medidas para diversas concentraes de substrato,
encontram-se na tabela seguinte.

Concentrao do Velocidade (moles/L.min)

substrato (M) pH = 7.6 pH = 9.0
1.74 x 10-5 74 34
2.67 x 10-5 85 47
5.26 x 10-5 98 75
16.66 x 10-5 114 128

Calcule o Km da enzima para cada pH e diga a que valor de pH a enzima

tem maior afinidade para o substrato.
37
Exemplo de clculo 2.14. (7.13 in Fogler)
Foi observada a ocorrncia da inibio de um substrato na seguinte reaco
enzimtica:
E + S = E.S a) Mostre que a equao de velocidade da reaco
E.S P + E para a sequncia de reaces acima consistente
E.S + S = S.E.S com o grfico da Figura P7-13, que representa rS
(mmol/L.min) versus a concentrao do substrato
S (mmol/L).

38
b) Se a reaco fr processada num CSTR com um volume de 1000 dm3,
para o qual o caudal volumtrico 3.2 dm3/min, determine os trs
possveis estados estacionrios, verificando, se possvel, quais so
estveis. A concentrao do substrato na alimentao 50 mmol/dm3.
Qual a converso mais elevada?

c) Qual seria a concentrao do substrato no efluente se a concentrao

total do enzima fosse reduzido em 33%?

2.15. (7.14 in Fogler)

Num estudo sobre o fermento usado no fabrico de po num determinado
meio, a 23.4C e vrias presses parciais de oxignio, foram obtidos os
seguintes resultados (consumo de oxignio com e sem o inibidor
sulfanamida):

39
 QO2 (20 mg de
QO2 (sem
PO2 sulfanamida/ml
sulfanamida)
adicionadas ao meio)
0.0 0.0 0.0
0.5 23.5 17.4
1.0 33.0 25.6
1.5 37.5 30.8
2.5 42.0 36.4
3.5 43.0 39.6
5.0 43.0 40.0
PO2 = presso parcial do oxignio (mmHg);
QO2 = taxa de consumo de oxignio (L de O2 por hora por mg de clulas)

a) Calcule o QO2 mximo (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten Km.

(Resposta: Vmax = 52.63 L O2/h.mgclulas).

b) Usando o traado de Linewear-Burk, determine se a sulfanamida

um inibidor competitivo ou no-competitivo no consumo de O2.
40