El Centro Activo Enzimtico

- La evidencia cintica lleva a concluir que las enzimas

funcionan a travs de la formacin de un complejo ES

- El complejo ES es estequiomtrico: existe una relacin

entera entre nmero de molculas de enzima y nmero de
molculas de substrato (1:1, 1:2, etc)

-La fijacin de S a E es estereoqumicamente especfica, y S

puede ser desplazado de su fijacin por anlogos estructurales
(inhibidores competitivos)

-De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una regin

especfica de la molcula enzimtica, llamada Centro Activo
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1

1. Formacin de complejo ES evidenciable cinticamente

2. Presencia de grupos prostticos que participan en la catlisis

3. Fenmeno de la inhibicin competitiva y efecto de los anlogos

de estado de transicin

4. Efecto de inhibidores irreversibles:

- Organofosfricos slo reaccionan con Serina activa

- Clorometilcetonas slo reaccionan con Histidina activa
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2

5. Estudios filogenticos en secuencias de aminocidos en enzimas

Tripsina CQGDSGGPV
Quimotripsina CMGDSGGPL
Elastasa CQGDSGGPL
Trombina CEGDSGGPF
Plasmina CQGDSGGSW
Pr. Sorangium GRGDSGGST
Pr. St.griseus CQGDSGGPV
Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 3

6. Estudios de fijacin de anlogos de substrato marcados

7. Estudios estructurales por cristalografa de rayos X de

enzimas cocristalizadas con su substrato (p.e., lisozima)

8. Otras tcnicas fsicas (RMN, RSE, polarizacin de fluorescencia)

Lisozima y su
substrato
Nmero de centros activos

1. Estudios de fijacin de ligandos

2. Nmero de grupos prostticos
3. Reactivos especficos de centro activo (Organofosfricos)
4. Titulacin directa del centros activos
Estudio de fijacin de ligandos

Consisten en incubar la enzima con un anlogo del substrato

debidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a dife-
Rentes concentraciones de ligando.

Ligando libre y ligando unido pueden separarse por:

- Dilisis de equilibrio
- Ultrafiltracin
- Cromatografa de exclusin en gel.
Aminocidos presentes en el centro activo de enzimas

- Serina: enzimas inhibidas por organofosfricos

- Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas
- Cistena: enzimas inhibidas por reactivos SH
- Lisina: enzimas que forman bases de Schiff
- Aspartato y Glutamato: dependencia de pH
Mecanismos de accin enzimtica, 1

1. Efectos de proximidad y orientacin

Las enzimas logran en su centro activo una concentracin

local de reactivos mucho mayor que cuando stos estn
en solucin (efecto de proximidad)

Adems, la fijacin al centro activo se hace en la orienta-

cin correcta (efecto de orientacin)
 Colisiones
no productivas

Colisin
productiva

En la superficie de la enzima,
los reactivos se encuentran
en la orientacin correcta y a
una concentracin local mucho
mayor que en solucin
Mecanismos de accin enzimtica, 2

2. Catlisis general cido-base

3. Formacin de intermediarios covalentes

4. Otros efectos (efectos cunticos, por ejemplo)

 Mecanismo de la ribonucleasa pancretica, 1

B
O B
O

O OH
- O OH
P O -
O O CH2 Py P O
O O O CH2 Py
His 12 O His 12
Lys 41
:N Lys 41
O OH NH HN + NH
NH3 + - O O
P O NH3+ O P
O O CH2 B O
His 119 O CH2 B
His 119 H O
HN NH+
HN N:
O OH O OH
-
P O P O
-
O O CH2 O O CH2
 Mecanismo de la ribonucleasa pancretica, 2

B B
O O

O OH
- O OH
P O -
O P O
O CH2 Py O
O O CH2 Py
His 12 O
His 12
Lys 41
HN + NH Lys 41
O O :N
NH3+ H - P +
HO O NH
O O NH3 -
O
H O P O
His 119
His 119 O-
HN N:
HOCH2 B HN NH+
O
HOCH2 B
O

O OH
-
P O O OH
O O CH2 -
P O
O O CH2
 Mecanismo de las serinproteinasas

Ser CH His CH
Ser His
CH2 CH2
CH CH
CH2 CH2
NH
OH :N
O- HN + NH
-
R C NH R' O O
R C NH R' -O O
O C
O C
Asp
CH Asp
CH

1 2
 Mecanismo de las serinproteinasas

Ser CH His CH His

Ser
CH2 CH2
CH
CH
CH2
+ NH CH2
O HN :N NH
O -
- O O
R C NH R' O O NH2 R'
R C C
- C
O O
Asp Asp
CH CH

3 4
 Mecanismo de las serinproteinasas

CH His CH His
Ser Ser
CH2 CH2
CH CH
CH2 CH2
:N NH + NH
O HN
H
-
O O O - -
O
R C H O C H
O O
R C C
O
Asp O
Asp
CH
CH

5 6
 Mecanismo de las serinproteinasas

CH His CH His
Ser Ser
CH2 CH2
CH CH
CH2 + NH CH2
HN :N NH
O- - OH
O O -
O O
O C C
R C
Asp Asp
OH
CH CH

7 8
 Asp 102
His 57

Ser 195

Configuracin en el centro
activo de la Quimotripsina,
con un inhibidor