MINICURSO TERICO E PRTICO

Expresso e Purificao de
Protenas Recombinantes

Ministrante: Prof. Dr. Abelardo Silva Jr

Auxiliar: Tiago Jaquel Zilch
DNA recombinante,

Expresso,

Purificao e

Anlises
A tecnologia de DNA recombinante o
conjunto de tcnicas que permite a
combinao de segmentos de DNA com
origens diferentes de forma a originar
uma nova molcula de DNA.
usada na clonagem de genes, na
modificao gentica de organismos e
na biologia molecular de uma forma
geral.
VETOR HOSPEDEIRO EXPRESSO PURIFICAO

Isolamento Transformao de
Amplificao clulas hospedeiras e
Digesto seleo dos clones
Purificao do Replicao
Fragmento alvo Anlise
Clonagem em Expresso do DNA
vetores e da protena
 Vetor Hospedeiro Tipo de clonagem Tamanho do
inserto

Plasmdeo Bactria Genmica/cDNA 510 kb

Bacterifago Bactria Genmica/cDNA < 20kb

Cosmdeos Bactria Genmica < 50kb

Cromossomos Levedura Genmica 100-1000kb

Artificiais
Os vetores precisam ter : Replicador

Stios de Marcador
clivagem de
Seletividade

Replicador : uma seqncia especfica do vetor, na qual tem incio a

replicao do DNA,

Marcador de Seletividade : Ser responsvel pela identificao do hospedeiro

que recebeu o vetor corretamente, so genes que codificam protenas que
degradam antibiticos,

Stios de Clivagem: ou stios de clonagens, consiste em uma seqncia de

nucleotdeos que corresponde a stios de interao com enzimas de restrio, as
mesmas enzimas que devem ser utilizadas para preparao do inserto.
 Gene de
interesse

ENZIMAS DE
RESTRIO
VETOR VETOR
CLIVADO
INSERTO
INSERTO
CLIVADO

VETOR
DNA LIGASE
CLONADO
HOSPEDEIRO VANTAGENS DESVANTAGENS
bactrias Nveis elevados de expresso das acumulao intracelular de protena
protenas recombinantes, crescimento produzida, a possibilidade de degradao
E. coli
rpido da populao celular num meio do produto por proteases contaminantes
de cultura simples e produo de endotoxinas

leveduras No produzem endotoxinas. So A glicosilao das protenas

Saccharomyces cerevisae, capazes de glicosilar protenas. Nveis no exatamente como nos
Hansenulla polymorpha elevados de expresso das protenas sistemas de mamferos
Pichia pastoris recombinantes. Crescimento rpido
num meio de cultura simples
clulas de mamfero j so capazes de glicosilar as O custo de produo nestes sistemas
clulas de ovrio de protenas no locais correctos, muito mais elevado devido ao seu
hamster chins, CHO, embora, com algumas lento crescimento e necessidade de
cl. de rim de hamster diferenas no tipo de meio nutritivo dispendioso
beb, BHK modificao glicosdica
Bactrias competentes
Para que a bactria receba o DNA, ela precisa estar
competente, ou seja, apta para isso

Dois principais tipos de POP para produo de clulas

competentes: Qumica e eletricamente.
 Transformao
e Replicao

Seleo e
Isolamento dos
clone
confirmados
Induo
 Meio de Induo
(TB, LB, Suplementado com AAs raros ? qual o melhor ? )
Temperatura
(Crescer a 37C, induzir com 25C ? 30C ? 37C ?)
Tempo
( 4h, 8h, 12 ou 16 h ?)
Agitao
(180 rpm ? 100rpm ?)
Concentrao do Indutor (ITPG)
(1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,01mM ?)

VOC TER QUE DESCOBRIR, NO

H UM PADRO !
Aps a induo, e localizao da frao proteica em que sua protena
se encontra ( frao solvel, corpo de incluso ou secretada para o
meio) agora comearemos a purificao.

De acordo com o plasmdeo escolhido, ou com o tipo de protena

sendo expressa, agora partiremos para a purificao.
Podendo ser de diversos tipos :
Precipitao com sal ou carboidratos de alta massa molecular,
Afinidade eletrnica (IMAC),
Diferena de tamanho (excluso molecular),
Troca inica,
Filtrao, entre outros...

Este minicurso utilizar o mtodo de rpida cromatografia lquidas de

protenas (FPLC) com o equipamento KTA pure da G&E
 protenas

Protenas
protenas

protenas
purificadas

Protenas

= on metlico
= Competidor = protena de interesse ( cauda
( imidazol) de histidina)
O sistema possui :
2 bombas ( sendo 4
possibilidades de vlvulas)
Medidores de presso
Medidor de pH
Sistema de coleta
fracionada
Sistema de programao
Cromatograma
Acompanhamento do
sistema em tempo real.

Sistema simples, porm precisa de ateno para manuseio!

 Ao iniciar precisa-se fazer a purga do sistema
As solues precisam ser filtradas
Limpeza correta
Respeito dos limites de presses das colunas e
do sistema
Estocado em etanol 20%
 Cromatograma
Anlise de fluxo x tempo de reteno

Fluxo rpido x tempo de reteno curto Fluxo mais lento x tempo de reteno mais longo

Cromatograma ideal
 Eletroforese
DNA recombinante
Transformao
Induo
Extrao
Purificao
Anlises dos resultados
LEMBRE-SE QUE NO H RECEITA DE BOLO, APENAS DICAS DE
COMO FAZER, MAS VOC QUEM TER DE FAZER AO SEU JEITO,
COMO FOR MELHOR PARA SUA CITUAO.