Engenharia Bioquímica - Aula 03 - Cinética Microbiana

Engenharia Bioqumica
Cintica microbiana
Introduo
Estudo cintico
Anlise da evoluo da concentrao de um ou
mais componentes em funo do tempo
Dados necessrios ao dimensionamento de uma
instalao e escalonamento do processo
Comparao quantitativa entre condies
diferentes de cultivo
Mestrado em Engenharia de Alimentos Engenharia Bioqumica

URI-Campus de Erechim Prof. Marco Di Luccio
Introduo

Simplificaes comuns
Um nico substrato limitante
Outros S em excesso
Presena de inibidor ocasionalmente

Controle de pH, T, O2
Para que afetem pouco a cintica

Parmetros de transformao
Velocidades instantneas de transformao
Velocidades especficas de transformao
Fatores de converso
Coeficientes especficos de manuteno

Crescimento microbiano
Culturas em batelada
Primeiro processo a ser investigado
Precisa ser bem descrito
Sistema fechado
Quantidade limitada de nutriente
Carga de meio de uma s vez
Inoculada um certa quantidade de
microrganismos


Velocidades (taxas) instantneas de crescimento
ou transformao (vem de Balanos de Massa)
Clulas
Substrato
Produto

Velocidades especficas de crescimento ou
transformao
CATALISADOR DO PROCESSO
CLULAS
Concentrao do catalisador
varia com o tempo!!
E AGORA???
Velocidades especficas de crescimento ou
transformao
Concentrao do catalisador
varia com o tempo!!
E AGORA???
NORMALIZAM-SE AS TAXAS PELA
CONCENTRAO DO CATALISADOR!!

Velocidades (taxas) ESPECFICAS de crescimento
ou transformao
Clulas ( ou X)
Substrato (qS ou S)
Produto (qP ou P)

SUBSTRATO
Manuteno Produto
Clulas

Fator de converso
Depende da espcie do m-o
Depende da natureza do meio
Depende das condies operacionais (tempo de
fermentao, agitao, oxignio disponvel, etc)
Deve-se ainda considerar que as clulas utilizam
substrato no s para o crescimento, mas tambm
para manuteno!

Fatores de rendimento celular

Substrato em clulas (YX/S)
Global
dX
dt dX rX X
YX / S Instantneo
dS dS rS S
dt


Substrato em produto (YP/S)
Global
dP
dt dP rP P
YP / S Instantneo
dS dS rS S
dt

SUBSTRATO
Manuteno Produto
Clulas

Manuteno
Trabalho osmtico para manter o gradiente de

concentrao
Modificao de componentes celulares
Mobilidade celular
Coeficiente de manuteno (Pirt, 1975)
rs m rs rs m rs c
m
X
Yx/s
Culturas em batelada
Primeiro processo a ser investigado
Precisa ser bem descrito
Sistema fechado
Quantidade limitada de nutriente
Crescimento tpico
Fases
Lag
Log ou exponencial
Desacelerao
Estacionria
Morte ou desativao celular
1 lag
2 transio
3 exponencial
4 linear
5 desacelerao
6 estacionria
7 decaimento ou lise

Fase lag
Perodo onde no h crescimento
Adaptao
Deve ser reduzida ao mnimo - Bom inculo !!!
Concentrao de inculo
Idade do inculo
Estado fisiolgico do inculo
Fase de transio
Aumento gradual da taxa de crescimento

Fase Exponencial
Se segue aps um perodo onde a taxa de
crescimento cresce gradualmente
Crescimento a taxa constante e mxima

Fase Exponencial
Descrio matemtica (Gaden, 1955) (definio de x)
1 dX
x
X dt
dX/dt velocidade instantnea de crescimento (rx)
X - concentrao de biomassa
t tempo (h ou dias)
x - velocidade (taxa) especfica de crescimento (h-1

ou dia-1)
Fase Exponencial
Descrio matemtica crescimento em batelada
dX
X
dt
dX/dt velocidade instantnea de crescimento (rx)
X - concentrao de biomassa
t tempo (h ou dias)
- velocidade (taxa) especfica de crescimento (h-1
ou dia-1)
Fase Exponencial
Integrando-se obtemos:
t
X t X0 e
X0 - concentrao inicial de clulas
Xt concentrao de clulas no tempo t
e logaritmo neperiano
Equao pode ser linearizada e se obter o parmetro

Fase Exponencial
Linearizao: Tirando-se o ln:
ln Xt ln X0 t
Plotando-se lnXt x t, ser dado pela inclinao

da reta
Na fase exponencial os nutrientes esto em excesso
Crescimento a taxa mxima

Fase Exponencial
Tempo de duplicao ou tempo de gerao
2Xt ln 2 0,693
ln max t g max
Xt tg tg
Algumas bactrias E. coli tg = 20 minutos!
Leveduras 1 a 2 h
Fungos normalmente > 2 h

Fase Exponencial
Alguns valores de mx para alguns m-os
Organismo mx (h-1)
Vibrio natrigiens 4,24
Mthylomonas 0,53
methanolytica
Apsergillus nidulans 0,36
Penicillium chrysogenum 0,12
Fusarium graminearum 0,28
Clulas vegetais 0,01-0,046
Clulas animais 0,01-0,05

Fase de desacelerao
Crescimento consumo de nutrientes +

excreo de produtos
Aps certo tempo taxa de crescimento

decresce
Crescimento cessa
Falta de nutrientes (limitao de substrato)
Acmulo de algum produto txico
Combinao dos dois efeitos

Fase estacionria
Crescimento nulo
Crescimento = morte
Onde h produo de metablitos

secundrios

Fase de morte celular ou declnio
Queda na concentrao de clulas
Taxa de morte > taxa de crescimento
Taxa de crescimento nula
Lise celular devido ao de enzimas

hidrolticas

Medidas de crescimento celular
Diluio
Normalmente nmero de m-os em uma

fermentao elevado
Boa reprodutibilidade dos resultados

Contagem direta em cmaras calibradas
+ microscpio
Adeso dos m-os na pipeta (de vidro ou
plstico) ou aglutinao
Suspenso dos m-os em soluo salina
taponada a pH 7,5 contendo detergente
Teepool, Tween 80
Cmara tem volume calibrado na rea de
contagem
No necessrio contar toda a cmara
Resultados em clulas/mL
Problema: no diferencia clulas viveis e
URI-Campus de Erechim
inviveis
Prof. Marco Di Luccio
Contagem utilizando Coulter
Equipamento que mede a passagem de
partculas atravs de um orifcio pequeno
No diferencia viveis de inviveis
Contagem por esfregaos corados
1 gota de suspenso de volume conhecido
(0,01 mL)
rea de 1 cm2
Seca-se, fixa-se e cora-se
Problema: m-os no se distribuem
homogeneamente na gota
Turbidimetria
Escala de MacFarland
Solues que do turbidez padro
Ex: 0,1 mL de cloreto de brio 10g/L + 9,9
mL de cido sulfrico 1% fornecem turbidez
semelhante a uma suspenso de 300
milhes/mL de bactrias
Problema:
No muito preciso
Mtodo visual
Composio do meio pode afetar
Contagem de m-os vivos
Espalhamento de uma amostra em placa
contendo meio slido
0,05 a 0,1 mL
Resultados expressos em UFC/mL
Vantagem: clulas viveis
Desvantagem: demorado e trabalhoso
Filtrao em membrana
Filtrao em membrana de 0,2 micra
Incubao na superfcie de um meio
Contagem de colnias
Nmero mais provvel (NMP)

Vrias diluies
Inocula-se uma srie de tubos (at 10) um

volume conhecido de cada diluio
Anota-se os tubos onde houve turvao

(crescimento) ou no
A proporo de tubos turvos e no turvos

pode ser levada a uma tabela que fornece o
NMP
Medidas de crescimento celular Biomassa
Pesagem direta
No muito preciso material mido
Contedo de gua pode variar
Material celular seco
Mais preciso
Demorado e trabalhoso
Centrifugao, lavagem e secagem
Filtrao, lavagem e secagem
Serve para bactria, leveduras e fungos
filamentosos

Turbidimetria com espectrofotmetro
Quanto maior o nmero de m-os maior a
disperso de luz
Normalmente 540-600 nm
Resultados expressos em unidades de D.O.
Pode-se relacionar com uma curva de peso
seco
Resultados em g peso seco/ L
Mtodo rpido e preciso (dependendo do
mtodo da construo da curva)
Dosagem de componentes celulares
Nitrognio e protena
Kjeldahl
Lowry
Problema: nem sempre o crescimento celular
proporcional o N e PTN
DNA e RNA

Dosagem de produtos de atividade

metablica
Desaparecimento de acares
Consumo de oxignio
Aparecimento de dixido de carbono

Classificao de processos fermentativos
Crescimento associado
Crescimento e produo de P andam juntos
Metablitos primrios (f. alcolica, algumas
vitaminas e aminocidos)

URI-Campus de Erechim Fermentao alcolica
Crescimento no associado
Crescimento e produo de P andam separados
A mxima taxa de produo de P s ocorre qdo as
demais j esto bem reduzidas
Metablitos secundrios: antibiticos e toxinas

URI-Campus de Erechim Fermentao penicilina
Crescimento parcialmente associado
Crescimento e consumo de S andam juntos
Produo de produto comea depois
Perfis de taxa bem parecidos
Produo de produto no est diretamente ligada ao
metabolismo energtico
Fermentao ctrica

Cuidado!
Em uma mesma fermentao podem ocorrer os
trs tipos de mecanismos
Depende s do produto que estamos
analisando...

Modelo de Monod
Queda na taxa de crescimento devido
limitao de substrato
Relacionou com concentrao residual de
substrato no meio
max S

Ks S
Ks constante de utilizao de substrato (ou
de saturao)
igual [S] quando 0,5 mx
Modelo de Monod
mx
Taxa especfica de crescimento ()
Fase exponencial
Concentrao residual de substrato limitante

Modelo de Monod
Se Ks pequeno alta afinidade pelo

substrato
Fase exponencial se alonga
Fase de desacelerao se encurta
Se Ks grande baixa afinidade pelo

substrato
Fase exponencial pequena
Fase de desacelerao grande

Modelo de Monod
Ks= 0.60mg/L (b)

Ks= 0.03mg/L (a)

Modelo de Monod
Valores tpicos de Ks
Organismo Substrato mx (h-1) Ks (mg/dm3)

E. coli Glicose 0,8-1,4 2-4
Glicerol 0,87 2
Lactose 0,8 20
S. cerevisiae Glicose 0,5-0,6 25
Candida sp. Hexadecano 0,5 0,045-0,45

Modelo de Monod
Determinao de mx e Ks
Idntico cintica enzimtica!!!
Linearizao de Lineweaver-Burk

Desvios do modelo de Monod
Morte celular
Tessier
Moser

Contois
Andrews (inibio por substrato)
Inibio por produto

Inibio por produto
Dois substratos limitantes



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Depende das condies operacionais (tempo de

fermentao, agitao, oxignio disponvel, etc)

Deve-se ainda considerar que as clulas utilizam

substrato no s para o crescimento, mas tambm

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Modificao de componentes celulares

Coeficiente de manuteno (Pirt, 1975)

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Perodo onde no h crescimento

Deve ser reduzida ao mnimo - Bom inculo !!!

Estado fisiolgico do inculo

Aumento gradual da taxa de crescimento

Se segue aps um perodo onde a taxa de

crescimento cresce gradualmente

Crescimento a taxa constante e mxima

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Descrio matemtica (Gaden, 1955) (definio de x)

x - velocidade (taxa) especfica de crescimento (h-1

X0 - concentrao inicial de clulas

Xt concentrao de clulas no tempo t

Equao pode ser linearizada e se obter o parmetro

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Linearizao: Tirando-se o ln:

Plotando-se lnXt x t, ser dado pela inclinao

Na fase exponencial os nutrientes esto em excesso

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Tempo de duplicao ou tempo de gerao

Algumas bactrias E. coli tg = 20 minutos!

Fungos normalmente > 2 h

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Vibrio natrigiens 4,24

Penicillium chrysogenum 0,12

Fusarium graminearum 0,28

Clulas vegetais 0,01-0,046

Clulas animais 0,01-0,05

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