El Microscopio

Lic T. M. Ricardo Santos S

 Qu es Microscopa?
La microscopa es la
tcnica de producir
imgenes visibles de
estructuras o detalles
demasiado pequeos
para ser percibidos a
simple vista. En este
campo ha habido gran
impulso por parte de la
fsica.
HISTORIA: EL INVENTO
Se invent,
hacia 1610, por
Galileo, segn
los italianos, o
por Jansen, en
opinin de los
holandeses
EL NOMBRE
La palabra
microscopio fue
utilizada por
primera vez por los
componentes de la
"Accademia dei
Lincei
Micro=pequeo
Scopein=ver
 GALILEO GALILEI

La Accademia dei
Linceii era una
sociedad cientfica a
la que perteneca
Galileo y publicaron
un trabajo sobre la
observacin
microscpica del
aspecto de una abeja
MALPIGHI
Las primeras
publicaciones
importantes aparecen
en 1660 y 1665
cuando Malpighi
observa los capilares
sanguneos y Hooke
publica su obra
Micrographia
 ANTONY VAN
LEENWENHOEK
En el siglo XVII un
comerciante
holands, utilizando
microscopios simples
de fabricacin propia
describi por primera
vez protozoos,
bacterias,
espermatozoides y
glbulos rojos
MICROSCOPIO DE
LEEUWENHOEK
CARACTERSTICAS DEL MICROSCOPIO
DE LEEUWENHOEK

El primitivo
microscopio de
Leeuwenhoek tena
dos lupas
combinadas con las
que lleg a alcanzar
260 aumentos, lo cual
le permiti visualizar
algunos protozoos e
infusorios
MICROSCOPIOS DEL SIGLO
XVIII
ERNST ABBE
Las mejoras mas
importantes de la
ptica surgieron
en 1877 cuando
Abbe publica su
teora del
microscopio
 CALR ZEISS

Mejora la
microscopa de
inmersin
sustituyendo el
agua por aceite de
cedro lo que
permite obtener
2000 aumentos
EVOLUCIN DEL
MICROSCOPIO
FUNDAMENTO DE LA
MICROSCOPA
Cuando el observador
se acerca el objeto se
agranda
Pero a menos de 25
cm no se ve con
claridad
Si se aumenta el
ngulo visual se ve
con claridad
 ESQUEMA DEL
MICROSCOPIO
Un tubo cilndrico aloja
el sistema ptico
ocular/objetivo. Una
platina de original
diseo permite
observar las
preparaciones, que son
iluminadas por un
espejo cncavo que
concentra la luz sobre
el objeto a estudiar.
EL MICROSCOPIO

Los especmenes biolgicos

pueden ser muy pequeos. Por
esa razn, frecuentemente
usamos un instrumento ptico
que ampla la imagen, llamado
microscopio.

Existen muchos tipos de

microscopios: de luz,
electrnico, de contraste de
fase, de luz ultravioleta, de
fluorescencia. Los de uso ms
comn son: el microscopio de
luz y el microscopio
electrnico.
El microscopio de luz
Este instrumento magnifica y
enfoca los rayos de luz por medio
de lentes. Los rayos de luz pueden
ser naturales o artificiales.
El microscopio de diseccin o
estereoscopio se usa para estudiar
especmenes en tres dimensiones y
a baja magnificacin. La fuente de
luz est sobre el especimen.
El microscopio compuesto se usa
para estudiar porciones pequeas y
finas de especmenes en cortes
longitudinales o transversales.
Tiene diferentes magnificaciones y
se puede apreciar ms detalles. La
fuente de luz est debajo del
espcimen.
 Microscopio de diseccin
Microscopio Compuesto

http://sitios.seccionamarilla.com.mx/pmh/recursos/70.jpg
www.maicodemexico.com.mx/.../images/micro4.jpg
 http://microscopico.files.wordpress.com/2006/12/dscn1543.jpg

http://microscopico.files.wordpress.com/2006/12/dsc0158
2.jpg
PARMETROS PTICOS
Aumento
Poder de
resolucin
N de campo
Profundidad de
foco
Contraste
 AUMENTO

Se calcula
multiplicando
el aumento del
objetivo por el
aumento del
ocular
PODER DE RESOLUCIN
Distancia si dos
puntos se distinguen
Mayor, cuando menor
es la longitud de onda
Mayor, cuanto mas
grande es la apertura
numrica
Mayor, con aceite de
cedro
Nmero de campo
Es el dimetro
de la imagen
observada a
travs del
ocular,
expresado en
milmetros
PROFUNDIDAD DE CAMPO
CONTRASTE
Diferencia de
absorcin de luz
entre el objeto y
el medio
Puede
aumentarse con
las tinciones
BUENOS PARMETROS
Partes pticas

Ocular - La funcin del ocular

es aumentar la imagen
formada por el objetivo.
Algunos oculares presentan un
punto que sobresale en el
campo microscpico. Este es
un indicador que se usa para
facilitar la posicin de algn
punto especfico en su
observacin. Este indicador se
mueve haciendo girar el lente
ocular.
LENTES: OBJETIVOS
Estn colocados en el
revolver
Tienen un sistema de
amortiguacin
Un anillo coloreado
indica los aumentos
Son de 4, 10, 40 y
100 (inmersin)
aumentos
 Partes pticas
Objetivos

Objetivo de rastreo (4X):

Se observa el especimen completo.
Se usa para encontrar imagen.
Objetivo de baja potencia (10x):
Se usa para enfocar la imagen
Objetivo de alta potencia (40x):
Se usa para ver la imagen, con
mayores detalles.
Objetivo de inmersin de aceite
(100x): Se usa con aceite, el mismo
se aade antes de cambiar de
objetivo.
 Cmo calcular la magnificacin
total?

La magnificacin total del microscopio se puede

determinar multiplicando la magnificacin del objetivo por
el ocular.

Magnificacin Magnificacin Magnificacin

Objetivo
objetivo ocular total

Rastreo 4X 10X 40X

Baja potencia 10X 10X 100X

Alta potencia 40X 10X 400X

Partes pticas

Lmpara: El
microscopio est
provisto de una
fuente de luz
elctrica.

Partes mecnicas

Tornillo Macromtrico: Es el
tornillo de mayor tamao. Est
ubicado en la parte superior del
microscopio. Se usa con los
objetivos de 4x y 10x.

Tornillo Micromtrico:Este se
utiliza para movilizar la platina a
distancias muy pequeas, por lo
tanto se utiliza principalmente
para afinar el enfoque. Unico a
usarse cuando observamos objetos
con el objetivo de magnificacin
alta. Da un enfoque preciso de la
imagen, se usa con los objetivos de
40x y 100x.
 CONDENSADOR Y
DIAFRAGMA
Condensador:
concentra la luz de la
lmpara en un punto
de la preparacin
Diafragma o iris (est
dentro del
condensador):si se
cierra mejora el
contraste, pero
empeora la
resolucin
Partes mecnicas
Platina: Est colocada debajo de
los objetivos y se utiliza para
colocar las laminillas.

Ajustadores de platina:Dan
movimiento al carro mecnico.

Ganchos o carro mecnico:

Colocados sobre la platina para
sujetar la laminilla en la posicin
correcta.

Brazo: Apoya la parte superior y

provee para su manejo.

Base: Parte inferior por donde se

sujeta para su cargado.
 Campo
visual
Los lentes del Se enciende el
microscopio se deben microscopio, se
limpiar siempre antes coloca el objetivo de
y despus de usarse baja potencia en
con papel de lente.
posicin y se mira por
La laminilla a
el ocular intentando
examinarse debe
colocarse encima de localizar la imagen en
la platina, el rea observada la
centralizando el rea cual llamamos el
del cubreobjetos en la campo visual.
abertura de la misma.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
No poner la Mirando por fuera
preparacin al revs subir la platina
Regular la luz a Enfocar y ajustar
intensidad media Pasar al siguiente
Ajustar condensador aumento y enfocar
y diafragma al medio Al acabar retirar la
Empezar por poco preparacin
aumento Apagar la luz
 CONSERVACIN DEL
MICROSCOPIO
Ponerle su funda al
guardarlo
Limpieza de lentes
con papel de gafas
El exceso de xilol al
limpiar las lentes
desgasta el cemento
Usar pincel y pera de
aire
 TIPOS DE MICROSCOPIOS
Microscopio
ptico Simple Lupa
Microscopio
ptico M.O. Normal
Microscopio
Campo oscuro
ptico
Contraste de fases
Compuesto
Fluorescencia
Tipos de
microscopios

Transmisin
Microscopio Barrido
electrnico Digital
Efecto tnel o cuntico
MICROSCOPA DE CAMPO
OSCURO

Treponema pallidum
 El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado
de luz muy intensa en forma de un cono hueco
concentrado sobre el espcimen.
El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible
contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las
partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se
cuela en una habitacin cerrada.
Las porciones transparentes del espcimen quedan
oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven
brillantes.
Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar
elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar,
invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es
decir, sin matarla.
Tambin es bastante utilizado en la observacin de
muestras metalogrficas para la observacin de detalles
en superficies con alta reflectancia.
 MICROSCOPA DE
CONTRASTE DE FASES

Clulas epiteliales 20 x
 Es un microscopio ptico modificado que
permite contrastar sustancias de diferente
grosor o densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial
se controla la iluminacin de tal manera que
vaya en diferentes rutas a travs de las distintas
partes de una clula.
El resultado es una imagen con diferentes
grados de brillo y oscuridad.
Con este mtodo, el material denso aparece
brillante, mientras que las partes de la clula
que tienen una densidad cercana al agua
(citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares
sin necesidad de usar colorantes o matar
microorganismos.
 MICROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA

Clulas epiteliales 200 x

El microscopio de fluorescencia es una variacin del
microscopio ptico, dotado de luz ultravioleta en el
que los objetos son iluminados por rayos de una
determinada longitud de onda.
La imagen observada es el resultado de la radiacin
electromagntica emitida por las molculas que han
absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz
con mayor longitud de onda.
Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada,
se deben colocar filtros apropiados debajo del
condensador y encima del objetivo.
Se usa para detectar sustancias con
autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas
con fluorocromos.
Microscopio confocal
 Microscopio confocal
El microscopio confocal es en principio un
microscopio ptico que incluye como fuente de
luz un lser y un sistema electrnico que ayuda a
la captacin de imgenes.
Debido a esto, el microscopio confocal consigue
un aumento en la resolucin y obtener imgenes
de secciones pticas extremadamentes finas,
eliminando as la interferencia que produce la luz
que llega de los diferentes campos pticos de
todo el grosor de la muestra que se observa,
consiguiendo as que el enfoque se realice sobre
un nico plano (confocal).
Las imgenes obtenidas son digitales.
 Microscopio parafocal
En un microscopio parafocal todo lo que hay
que hacer es girar el revlver hasta que el
objetivo de alta potencia est en posicin y ya la
imagen estar enfocada.

Si el microscopio no es parafocal, se debe

aumentar la distancia entre el objetivo y la
laminilla antes de girar el revlver para que el
objetivo no vaya a chocar con la laminilla.
Entonces se coloca en el objetivo en posicin y se
vuelve a enfocar la imagen.
Microscopa Electrnica
Primer microscopio electrnico

El primer microscopio
electrnico fue diseado por
Ernst Ruska y Max Knoll
entre 1925 y 1930, quines
se basaron en los estudios
de Louis-Victor de Broglie
acerca de las propiedades
ondulatorias de los
electrones.
El microscopio electrnico

Este instrumento utiliza rayos de

electrones que se magnifican y se
enfocan en una placa fotogrfica
por medio de lentes
electromagnticos (imanes).

Tipos de microscopios electrnicos

Transmisin: usado para

observar detalles internos.

Rastreo o scanning: usado

para estudiar la superficie
de la muestra.
 Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se
encuentran :
Microscopio electrnico de transmisin (TEM).
Microscopio electrnico de barrido (SEM).
Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes
caractersticas de una muestra.
El SEM provee informacin sobre morfologa y
caractersticas de la superficie.
TEM podemos observar la estructura interna y
detalles ultraestructurales.
academic.uprm.edu/~jvelezg/microscopio.ppt
 Microscopio Electrnico de Rastreo

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2f/A_red_blood_cell_in_a_capillary,_pancreatic_tissue_-_TEM.jpg/746px-A_red_blood_cell_in_a_capillary,_pancreatic_tissue_-_TEM.jpg

Microscopio Electrnico de Transmisin

http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/504/482px-SEM_blood_cells.jpg
 Polen en hojas de helecho Hormiga, en MER
http://microscopico.files.wordpress.com/2006/12/polllen http://microscopico.files.wordpress.com/2006/12/angel2.jpg
3.jpg

Bacterias en MER
http://microscopico.files.wordpress.com/2006/12/bact1color.jpg
 Acaros en la almohada y la
cama; microscpicos

academic.uprm.edu/~jvelezg/microscopio.ppt
 Bacterias en la punta de un alfiler. MER

http://academic.uprm.edu/~jvelezg/microscopio.ppt
Comparacin entre el microscopio de luz y el electrnico

Microscopio de luz Microscopio electrnico

1. Fuente de iluminacin: luz 1. Fuente: rayo de electrones

2. Lentes: de cristal 2. Lentes: electromagnticos

3. Resolucin*: 0.1 m 3. Resolucin: 1nm= 0.001m

4. Magnificacin hasta 2,000x 4. Magnificacin hasta 1,000,000x

5. La muestra puede estar viva o muerta 5. Debe estar muerta y deshidratada

6. Muestra: se observa directamente 6. Muestra : se observa mediante pantalla
7. Costo: $50.00 hasta varios miles 7. Costo: $20,000.00 a $250,000.00

*Resolucin: capacidad de distinguir dos objetos que estn muy cerca.

 Una tabla comparativa, entre ambos
microscopios
MICROSCOPIO MICROSCOPIO
DE LUZ ELECTRONICO
Iluminacin Haz de luz Haz de electrones

Longitud de onda 2000 - 7500 0.037 - 0.086

Lentes Vidrio Electromagnticas

Medio Atmsfera Vaco

Resolucin 2000 3

Magnificacin 10 x - 2000 x 100 x - 450000 x

Focalizacin Mecnica Elctrica

Contraste Absorcin - Reflexin Scattering

PODER DE OBSERVACIN
DEL MICROSCOPIO
 RESOLUCION

El concepto de resolucin est relacionado con

la capacidad de distinguir detalles finos en una
imagen.

En otras palabras, es la distancia mnima r1 a la

cual podemos distinguir, claramente, dos puntos
como entidades separadas.
 La resolucin terica del
microscopio electrnico es:

Para valores de l = 0.037 y

a = 0.1 radianes, la resolucin
nominal es 0.2 .
Naturaleza De Las Ondas De Electrones

Mostr que una partcula movindose a una velocidad

cercana a la de la luz tena una forma de radiacin
asociada con ella. Esta relacin est expresada por:

Donde l es la longitud de onda, h la costante de

Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad.
 Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la
velocidad de la luz, l = 0.05 A. que es 100.000 veces
ms corta que la luz verde.
Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que
emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que
la de un microscopio de luz.
La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es
difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su
descripcin se hace mediante la mecnica cuntica.
 Las ondas de electrones se pueden pesar como un
quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada
electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece
con l.

Las caractersticas de estas ondas dependen de la

posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en
el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de
encontrar al electrn en esa posicin.

Las ondas de electrones no deben confundirse con

radiacin electromagntica.
 Microscopio Electrnico De
Transmisin

EL INSTRUMENTO
El sistema ptico-electrnico del microscopio
electrnico de transmisin est constituido por las
siguientes partes:
Can de electrones
Sistema de lentes
Pantalla fluorescente
Estos componentes
estn ensamblados en
una columna vertical
la cual se encuentra en
alto vaco.
 El can de electrones, es la
fuente emisora del haz de
electrones.
Se encuentra ubicado en la
parte superior de la columna.
Est constituido por un
filamento (ctodo), un cilindro
con una apertura central,
llamado cilindro de Wehnelt
que rodea al filamento y tiene
un potencial ligeramente ms
negativo que ste.
El nodo se encuentra por
debajo del cilindro de Wehnelt.
 El filamento es calentado por
el pasaje de corriente
(alrededor de 2800 K).
Los electrones emitidos
termoinicamente por el
ctodo son acelerados hacia
el nodo, pasan por la
apertura circular central de
ste y un haz de alta energa
es emitido hacia la columna
del microscopio.
El sistema de lentes est
formado por lentes
condensadores objetivo,
intermedia y proyectora.
 Las lentes condensadoras,
en los microscopios, ms
modernos son dos.
La primera, proyecta la
imagen punto de
entrecruzamiento
demagnificada (spot size),
mientras que la segunda
controla su dimetro y el
ngulo de convergencia en
que incide sobre la muestra.
limita al haz que incide
sobre la muestra.
 La lente objetivo forma la
primera imagen, localizada
debajo del espcimen.
Es considerada el
componente ms
importante del
microscopio electrnico.
Cualquier defecto en sta,
ser magnificado y
transmitido al resto del
sistema ptico.
Por lo tanto, de ella
dependen, en gran
medida, la resolucin
final y la correccin
de las aberraciones.
Las lentes intermedia
y proyectora son las
encargadas de
amplificar la imagen
dada por la lente
objetivo y proyectarla
sobre la pantalla
fluorescente.
 Mediante el microscopio electrnico de transmisin
podemos estudiar la ultraestructura de un material
orgnico o inorgnico.
Para esto, existen diferentes formas de operacin que
posibilitan el estudio de una caracterstica en
particular.
Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de
materiales no- biolgicos y biolgicos podemos
nombrar :
 Determinacin de estructura cristalina en minerales,
metales, etc.
Estudio de catalizadores. Estudios de citoqumica.
Determinacin de impurezas, precipitados, etc.
Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales.
Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros.
Determinacin de tamao de partcula en catalizadores,
minerales, etc.
Identificacin de planos cristalinos.
Cambios estructurales de materiales sometidos a
diferentes tratamientos trmicos.
Realizacin de estudios de histoqumica para identificxar
compuestos especficos.
Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y
animales.
Reconocimiento de virus.
Estudios de estructuras moleculares.
 MICROSCOPIO
ELECTRONICO DE
BARRIDO
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO

Inventado en 1931 por

E. Ruska y M. Knoll

Observacion , caracterizacion
superficial de materiales inorganicos
y organicos
La observacin de objetos pequeos siempre ha estado entre
los mayores desafos encarados por el hombre

A fines del Siglo XIX Abbe mediante la iluminacin con

ondas electromagnticas
J.J. Thomson descubri los electrones. En el ao 1924
D`Broglie sacude los cimientos del conocimiento de su poca
al enunciar el carcter ondulatorio de los electrones

En el ao 1926 Busch presenta el diseo de una lente

electromagntica;

E.Ruska y M. Knoll en 1933

inventaron el microscopio
electronico de transmision

Microscopio Electrnico de
Barrido (MEB) por el propio
Knoll en 1935
Ya en el ao 1938 M. von Ardenne introduce un sistema de
barrido en un MET, lo que dio lugar a un nuevo tipo de equipo,
el Microscopio Electrnico de Barrido-Transmisin (MEBT).
En el ao 1942 se produce un salto considerable en el
desarrollo del MEB con los trabajos que desarrollan Zworykin y
un conjunto de colaboradores.

En 1948, bajo un proyecto dirigido por C.W. Oatley, McMullan

aportaron al desarrollo del MEB

En el ao 1956 ocurre otro avance importante cuando K.C.A.

Smith introduce el procesamiento no lineal de las seales

En el ao 1986 surge la Microscopa Electrnica de

Barrido controlada mediante computadora.
Microscopia Electrnico de Barrido (SEM).

El microscopio electrnico de barrido (SEM) es similar al

microscopio electrnico de transmisin.
Ambos tienen ciertas caractersticas comunes tales como un
can de electrones donde se genera el haz de electrones,
lentes condensadoras y objetivo, sistema de vaco.
La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman
y magnifican la imagen.
Esto hace que la informacin que se obtenga de cada uno sea
distinta.
Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de
muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfologa
superficial.
 En el microscopio electrnico de
barrido, el haz electrnico, atraviesa la
columna y llega a la muestra.
Un generador de barrido es el
responsable de producir el movimiento
del haz , de manera que barra la muestra
punto a punto.
De la interaccin entre los electrones
incidentes con los tomos que
componen la muestra se generan
seales, las cuales pueden ser captadas
con detectores adecuados para cada una
de ellas.
El detector capta una seal y las
convierte en una seal electrnica que es
proyectada en un tubo de rayos
catdicos (CRT).
El barrido del haz est sincronizado con
el barrido del CRT y produce una
relacin uno a uno entre puntos de la
muestra y puntos en el CRT.
 Las aplicaciones del microscopio
electrnico de barrido son muy variadas.
Sus anlisis proporcionan datos como
textura, tamao y forma de la muestra.
 Mediante el SEM se estudian:

Morfologa superficial de minerales, catalizadores, etc.

Electrodepsitos
Adherencia fibra-matrz en polmeros.
Cambios morfolgicos de materiales sometidos a
tratamientos qumicos.
Formas de cristalizacin de minerales.
Control de calidad de catalizadores industriales.
Morfologa superficial interna de partculas polimricas.
Morfologa de tejidos u rgano animales y vegetales.
Estudio de molculas
Reconocimiento de fsiles.
Interaccin haz incidente - muestra en el SEM.
Naturaleza de la interaccin:
Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren
interacciones entre dichos electrones y los tomos que componen
la muestra.
De all surgen seales tales como:
Electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x
caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia.
Todas estas seales se producen simultneamente pero cada una
de ellas son captadas por detectores diferentes.
Uno de los detectores ms comunes es el de electrones
secundarios.
Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia
de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas.
Por esta razn, poseen baja energa (50 ev). Ellos brindan una
imagen de la morfologa superficial de la muestra.
 Unidades De Medida En Microscopia
La unidad que se usa en microscopa de luz es el
micrn () que es la milsima parte del milmetro.
En microscopa electrnica la unidad ms conocida es
el angstrom (), definido como la diez millonsima
parte del milmetro. Tambin se emplea el nanometro
(nm), que es la millonsima parte del micrn.
1 mm = 103 = 106 nm = 107
As, por ejemplo, la resolucin de un microscopio de
luz es 0.25 2500 ; y la de un microscopio
electrnico de 2.5
Vista general de un piojo (20X).(1cm=300 micras)
Detalle de ala de mariposa (220X). (1cm=30 micras)
 Detalle de bacterias (bacilos) a 10000X.
Las bacterias miden aproximadamente una micra.
Detalle de fibras de algodn (600X). (1cm= 10 micras)