REACCIN EN CADENA DE

LA POLIMERASA (PCR)
Fundamentos y
Aplicaciones.
OBJETIVOS

Describir el proceso de la reaccin en cadena de la polimerasa o

PCR.
Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.
Explicar las aplicaciones de este proceso
Qu es la PCR?

La reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) es una tcnica
de laboratorio comn utilizada
para hacer muchas copias
(millones o miles de millones!) de
una regin particular de ADN.
Por lo general, el objetivo de la
PCR es producir suficiente ADN
de la regin blanco para que
pueda analizarse o usarse de
alguna otra manera.
DESARROLLO

La reaccin en cadena de la
polimerasa fue desarrollada en
1983 por el Doctor Kary Mullis.
El Dr. Mullis recibi en 1993 el
Premio Nobel de Qumica por este
descubrimiento. Al recibir el premio
dijo esto:
Antes del la PCR, el DNA era largo
y fibroso, en absoluto molecular
Yo haba resuelto uno de los
principales problemas de la
qumica del DNA en un solo paso:
abundancia y distincin
 Qu componentes son necesarios para la PCR?

dNTPs (A;G;T;C)

Cofactor Mg2+
La Taq polimerasa

Al igual que la replicacin de ADN en un

organismo, la PCR requiere de una
enzima ADN polimerasa que produzca
nuevas cadenas de ADN mediante el
uso de las cadenas existentes como
molde.
La ADN polimerasa que normalmente
se utiliza en la PCR se
llama Taq polimerasa, por la bacteria
tolerante al calor de la que se aisl
(Thermus aquaticus).
Thermus aquaticus

T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes

hidrotermales.
Su ADN polimerasa es muy termoestable y su
mayor actividad se presenta cerca de los 70C
(temperatura a la que la ADN polimerasa de ser
humano o de E. coli no funcionara).
La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias
a esta estabilidad trmica.
Como veremos, la PCR utiliza altas
temperaturas repetidamente para desnaturalizar
el molde de ADN o separar sus cadenas.
CEBADORES PARA PCR

Al igual que otras ADN

polimerasas, la Taq polimerasa
solo puede hacer ADN si hay
un cebador, una corta secuencia
de nucletidos que proporciona
un punto de partida para la
sntesis de ADN.
En una reaccin de PCR, la
regin de ADN que ser copiada,
o amplificada, se determina por
los cebadores que el o la
investigadora elija.
Cuando los cebadores se unen al molde, la polimerasa los extiende y
la regin que se encuentra entre ellos se copia.
Explicacin

Ambos cebadores, apuntan "hacia adentro" al unirse, es decir, en direccin 5' a 3' hacia la
regin a copiar. Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede sintetizar
ADN en direccin 5' a 3'. Al extenderse los cebadores, la regin que se encuentra entre ellos se
copia.
 TERMINOS DE LA REACCIN DE LA PCR

Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado.

Se relaciona con los falsos positivos, ya que puede que una muestra sea
negativa pero sea dada como positiva porque se ha amplificado una
regin de ADN no diana o que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en
un nmero determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante
la amplificacin. Este concepto es de especial importancia en la
secuenciacin, pero en otros casos no es tan importante. Una buena
fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
TERMOCICLADORES
PROCESO DE LA PCR

El proceso que tiene lugar durante

la PCR se puede resumir de la
siguiente forma: partiendo de un
ADN molde, una enzima, la ADN
Polimerasa incorpora nucletidos
complementarios a partir de la zona
de doble cadena originada por la
unin de los cebadores al molde.
El proceso se da en tres fases:
Desnaturalizacin, hibridacin y
elongacin.
DESNATURALIZACIN

En primer lugar, se
desnaturaliza el ADN (se
separan las dos cadenas de
las cuales est constituido).
Este paso puede realizarse
de diferentes modos, siendo
el calentamiento (94-95 C)
de la muestra la forma ms
habitual.
HIBRIDACIN
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el
cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde.
Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40
segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento.
Esto permite que los cebadores se unan por complementariedad al
ADN molde.
ELONGACIN O EXTENSIN

Se produce la sntesis de una cadena sencilla en la direccin 5-> 3

mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los
desoxinucleotidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena
molde. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la
enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura
de elongacin suele ser de 72C.
RESUMEN
 Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reaccin de PCR tpica, que
generalmente tarda 2 - 4 horas, segn la longitud de la regin de ADN
que se copia. Si la reaccin es eficiente (funciona bien), puede producir
miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la
regin blanco.
Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo.
En realidad, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir
como molde en la siguiente ronda de sntesis de ADN. Hay muchas
copias de los cebadores y muchas molculas de Taq polimerasa flotando
en la reaccin, por lo que el nmero de molculas de ADN casi puede
duplicarse en cada ciclo.
La siguiente imagen muestra este patrn de
crecimiento exponencial
Qu se ha obtenido tras un ciclo de
PCR?

nicamente una copia de un pequeo fragmento del ADN molde.

El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de

su cantidad original se encuentra disponible para ser
nuevamente replicado en un segundo ciclo.
CMO SE PREPARA?
CMO SE PREPARA?

1. Primero se prepara la mezcla de

reaccin (en cantidad suficiente para
todas las muestras) que contenga
todos los componentes de la PCR, a
excepcin del ADN molde.
2. Una vez preparados los tubos de
reaccin se introducen en el
termociclador.
CONTROLES DE LA PCR

La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo.

Estos controles son necesarios para:
Comprobar que no exista contaminacin en la mix de reaccin (control
negativo)
Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un desperfecto en la
reaccin (control positivo).
CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde
CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe tiene el sitio de
pegado de primers
FALSOS POSITIVOS Y NEGATIVOS DE LA PCR

Causas de falsos positivos

- CONTAMINACIN!!

- Amplificacin inespecfica

Causas de falsos negativos

- Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)

- Extraccin del ADN defectuosa

- Mutacin en el sitio de hibridacin del cebador

- Baja concentracin o calidad del templado

- Concentracin incorrecta de Mg2+ o primers.

VARIANTES DE LA PCR

PCR ANIDADA
PCR DE EXTENSION SOLAPADA
PCR In Situ
PCR MULTIPLE
PCR CON TRANSCRIPTASA INVERSA
 APLICACIONES MDICAS

En Oncologa, la deteccin de translocaciones, mutaciones, deleciones, etc.,

aporta un mtodo ms objetivo y sensible al establecer un diagnstico, dado
que el estudio clsico de las neoplasias se fundamenta en la identificacin
histo patolgica de clulas malignas las cuales, sin embargo, se reconocen
slo si al menos 1%-10% de las clulas son neoplsicas.
La PCR ha ayudado a establecer el pronstico de distintas infecciones por
medio de la determinacin cuali/cuantitativa del virus de la hepatitis C o por
medio de la determinacin de la viremia plasmtica en la infeccin por el VIH,
en la que est reconocida la importancia de la determinacin de la carga
vrica en sangre en el pronstico de la infeccin y tambin en la evaluacin
del tratamiento.
 APLICACIONES MDICAS

Deteccin de bacterias y virus utilizando cebadores

especficos. Por ejemplo, la PCR puede descubrir la presencia
de virus latentes como los de la hepatitis B y C y el de
inmunodeficiencia humano (HIV) en el genoma de los
individuos infectados que no han desarrollado respuesta
inmune a dichos patgenos, por lo cuales no puede ser
detectado por ensayos con anticuerpos.
 APLICACIONES

Deteccin de mutaciones
Esta tcnica nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea
as la secuenciacin de ADN como un mtodo de diagnstico: una vez que se ha
caracterizado la relacin con una enfermedad de una determinada mutacin
puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la
galactosemia, mutaciones en c-Ras y cncer, etc..) o de una pequea delecin
(delecin de 3 bases en el gen CFTR en la fibrosis qustica), puede desarrollarse
un mtodo de deteccin rutinario. La secuenciacin automtica puede
emplearse como mtodo de screenig en la localizacin de nujevas mutaciones.
APLICACIONES DE LA PCR

Mediante el uso de la PCR, una

secuencia de ADN se puede amplificar
millones o miles de millones de veces y
producir suficientes copias de ADN
para que se analicen mediante otras
tcnicas.
Por ejemplo, el ADN se puede visualizar
por electroforesis en gel, enviar
a secuenciar o digerir con enzimas de
restriccin y clonar en un plsmido.
APLICACIONES DE LA PCR

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigacin, y tambin

tiene aplicaciones prcticas en medicina forense, pruebas genticas y
diagnsticas.
Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con
trastornos genticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en
el caso de pruebas prenatales).
La PCR tambin puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o
un virus en el cuerpo de un paciente: si el patgeno est presente, es
posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido.