HPLC

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

La cromatografa lquida de alta eficacia se encuadra dentro de la
cromatografa de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en
ntimo contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase
estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la
corriente de fase mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema
con una velocidad diferente que depender de su afinidad por cada
una de las fases. Esto supone que despus de terminado el recorrido
de la muestra por la columna, cada una de las substancias
introducidas en el sistema eluir con un tiempo diferente, es decir,
estarn separadas.
Despus de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y
haberse separado, pasan por un detector que genera una seal que
puede depender de la concentracin y del tipo del compuesto.
Tipos de HPLC

Los diferentes tipos de cromatografa lquida se pueden clasificar de

diferentes maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la
realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es
sta la que impone fundamentalmente el mecanismo de separacin;
de este modo, se pueden enumerar cuatro tipos de tcnicas:
Cromatografa de adsorcin (lquido-slido)
Cromatografa de reparto/adsorcin (fases ligadas qumicamente).
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular
Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo es
necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la
columna, la moderna cromatografa de lquidos de alta eficacia,
debido al pequeo dimetro de las partculas de fase estacionaria
que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos dispositivos que
constituyen el cromatgrafo.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:
Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de
mezclado de eluyentes).
Dispositivo de inyeccin.
Conducciones y conexiones.
Detector y registrador.
Columna
Adems de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden
incorporar en el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien
mejorar algn aspecto concreto de la tcnica cromatogrfica, como
pueden ser:
Inyectores automticos.
Colectores de fracciones.
Hornos termostatizados para las columnas
Sistemas de tratamiento de datos.
Sistema de suministro de fase mvil

La bomba
La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre
de pulsos de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea
influido por la presin en cabeza de columna, ya que sta puede
variar por obstruccin de las lneas de conduccin, del filtro de la
cabeza de la columna, etc.
Sistema de mezcla de fase mvil

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades;

isocrtico, cuando la fase mvil mantiene la misma composicin
durante la elucin, y en gradiente, cuando la composicin de la fase
mvil cambia segn una funcin dependiente del tiempo
Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la
fase mvil se conocen como mezclado a alta presin y mezclado a
baja presin
 Mezclado a alta presin
Este sistema de mezclado utiliza una
bomba para cada uno de los
disolventes que se van a mezclar,
estando la salida de cada bomba
conectada a una conexin en "T" o
a una pequea cmara de mezcla.
La denominacin de mezcla en
alta presin es debida a que la
mezcla se realiza una vez que los
disolventes han pasado la bomba
y, por lo tanto, han adquirido la
presin de trabajo
 Mezclado a baja presin
En los equipos de mezcla en baja
presin, el mezclado de los diferentes
componentes se lleva a cabo antes
de stos entren en la bomba (en la
zona de baja presin del sistema),
controlndose el caudal del sistema
cromatogrfico por medio de una sola
bomba. El mezclado de los
componentes se realiza por medio de
vlvulas porcentuales controladas por
rels, que estn calibradas para dar la
mezcla adecuada. El dispositivo de
control simplemente abre cada
vlvula durante un perodo de tiempo
adecuado, que ser funcin del
porcentaje de cada componente que
se precise en la mezcla
Sistemas de inyeccin

El mtodo de inyeccin de la muestra, es de importancia capital,

pues un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a
ensanchamientos de la banda cromatogrfica que deterioren la
eficacia del sistema cromatogrfico. Un inyector ideal debe tener las
siguientes caractersticas:
Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms
estrecha posible.
Ser de fcil manejo.
Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de
muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina en la
banda cromatogrfica.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Detectores

Un detector para cromatografa es un dispositivo que permite medir, a

la salida de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que
deber depender de la composicin de ste. La deteccin en
cromatografa se realiza, habitualmente, en continuo, aunque es
posible la utilizacin de colectores de fracciones para la identificacin
y cuantificacin de pequeas fracciones del eluyente.
Se puede hacer una divisin de los detectores en dos grandes grupos:
los que aportan informacin estructural sobre las substancias eluidas
(son aquellos detectores que permiten la obtencin de espectros de
las sustancias que salen de la columna, tales como IRTF, UV-VIS de
matriz de diodos, EM) y aquellos que no la aportan. Los pertenecientes
al primer grupo no son detectores de cromatografa de lquidos de uso
frecuente, aunque en la actualidad alguno de ellos se est
imponiendo a los detectores que no aportan informacin estructural.
Los detectores que no aportan informacin estructural, han sido hasta
el momento los de uso ms extendido; entre ellos deben mencionarse:
Detector ndice de refraccin.
Detector de ultravioleta y/o visible.
Detector de fluorescencia.
Detector de conductividad elctrica.
Detector electroqumico.
La columna

La columna es el elemento
fundamental de un cromatgrafo
de lquidos, puesto que es en ella
donde tiene lugar la separacin; por
lo tanto, resulta fundamental una
correcta eleccin de la columna
adecuada para cada separacin,
ya que con una columna
inadecuada o de mala calidad se
nunca se obtendrn buenos
resultados aunque se disponga del
mejor instrumental.
Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de
separacin son:
Dimetro interno
Longitud
Conexiones (reducciones)
Relleno
Tamao de partcula del relleno
Ventajas de la HPLC respecto a otros mtodos:
Tiempo de anlisis reducido
Menor consumo de disolventes
Menor dispersin de los solutos a analizar
Ahorro de costes
Mayor sensibilidad