PRINCPIOS DA CROMATOGRAFIA

Do grego, chroma, cor+ graphein,

escrever.
Descoberta por Mikhail Tswett (1903).
Consiste, basicamente, em passar uma
mistura de substncias dissolvidas em
um lquido (fase mvel) atravs de uma
coluna, contendo uma matriz slida e
porosa (fase estacionria).
PRINCPIOS DA CROMATOGRAFIA
medida que fluem atravs da coluna,
as protenas interagem com a fase
estacionria, dependendo da natureza
da interao: troca inica, filtrao ou
afinidade.
 TCNICAS DE SEPARAO
As protenas so purificadas por
procedimentos de fracionamento.
A idia eliminar seletivamente os demais
componentes da mistura, de forma que
somente a substncia de interesse
permanea.
A purificao das protenas mais uma arte
que uma cincia, pois obriga o analista a
conhecer muito bem sua protena-alvo, para
conseqentemente, escolher o melhor
mtodo de separao.
ESCOLHA DA TCNICA DE SEPARAO
PROPRIEDADE PROCEDIMENTO
* Carga * Cromatografia de
troca inica e eletro
forese
*Tamanho * Cromatografia de
filtrao em gel
* Ligao especfica * Cromatografia por
afinidade
 CROMATOGRAFIA
Introduo purificao de protenas
Era uma tarefa difcil devido s baixas
concentraes

HEMOGLOBINA: altas concentraes, 1/3

da massa dos glbulos vermelhos. A mais
estudada.
CROMATOGRAFIA
1 PASSO:
Remov-la da clulae e coloc-la em
soluo.
Moagem e esmagamento da clula que a
contm
Detergente ou solvente orgnico que possa
solubilizar
Hemolisante: rompe as hemceas e libera a
hemoglobina
ESTABILIZAO DAS PROTENAS
Uma vez removida a protena do seu
ambiente natural, ela fica exposta a muitos
agentes que podem danific-la de forma
irreversvel.
pH
Temperatura
Enzimas degradativas ( proteases )
Adsoro s superfcies
Armazenamento por longo tempo
 SOLUBILIDADE DAS PROTENAS
Em razo de suas cargas eltricas, a
solubilidade das protenas depende da
concentrao de sais dissolvidos.
Sendo que tal solubilidade aumenta,
proporo que sais so adicionados. Contudo,
decai se muito sal for adicionado.
Visto que as diferentes protenas so
precipitadas em diferentes concentraes de
sal, a adio de sal utilizada para separar
(purificar) protenas.
 PRECIPITAO DE PROTENAS
Por precipitao, pode-se remover as
protenas indesejadas de uma mistura por
meio do simples ajuste da concentrao de
sal;
Adiciona-se o sal at mais ou menos o ponto
de precipitao da protena a ser purificada;
Assim, aps remover as protenas
indesejadas, a concentrao de sal
aumentada ainda mais de forma a precipitar
a protena de interesse.
DESCRIO DA TCNICA DA CTI

As protenas a serem separadas so

dissolvidas em uma soluo-tampo,
contendo pH e concentrao de sal
apropriados;
Em seguida, so aplicadas na coluna,
contendo o trocador de ons ( resinas);
DESCRIO DA TCNICA DA CTI
Lava-se a coluna com soluo tampo
fraca para eluir (remover) as protenas
com pouca afinidade pelo trocador de
ons;
Aplica-se um novo tampo forte,
chamado eluidor, para remover a
protena de interesse, ligada matriz;
 CROMATOGRAFIA DE T. INICA
Na C T I, as molculas carregadas ligam-se
aos grupos de carga de sinal contrrio
imobilizados na matriz;
Assim, os ctions ligam-se aos nions e os
nions aos ctions;
Os principais trocadores de ons so:
Dietil-aminoetil (DEAE): trocador de nions
Carboximetila (CM): trocador de ctions
Resinas: CELULOSE e AGAROSE
 DOSAGEM DA Hb-G
A resina de troca inica ( MATRIZ FIXA),
carregada negativamente, exibe uma
afinidade para molculas positivas;
Em fora inica e pH selecionados, a
hemoglobina glicada ( Hb-G), tem carga
positiva menor que a Hb-A e se liga mais
fracamente resina;
A aplicao do tampo ( Hb-rpida ) promove
a eluio da Hb-G, ficando as outras
hemoglobinas retidas na coluna;