ANLISES

BROMATOLGICAS

PROTENAS
EM ALIMENTOS

Profa. Ionara F. R. Vieira

PROTENAS
DEFINIO
Substncias orgnicas complexas (C, H, O,
N, S, P, Fe, Cu, Zn).
Polmero de alto peso molecular
Unidade bsica: aminocidos

IMPORTNCIA
nutricional
propriedades 2
sensoriais
PROTENAS
AMINOCIDOS (aa)
Unidades estruturais bsicas das
protenas

3
 AMINOCIDOS (AA)

Cada aminocido tem uma cadeia lateral

(R) caracterstica, que influencia suas
propriedades fsico-qumicas.
Diferenas: tamanho, estrutura e carga
eltrica.
Arranjo tetradrico atividade tica
ismero L e D
S os aminocidos L so constituintes de
protenas naturais. 4
 AMINOCIDOS (AA)

Apolares ou hidrofbicas, exemplos:

leucina fenilalanina
alanina

valina triptofano metionina5

 AMINOCIDOS (AA)

Polares ou hidroflicos,
exemplos:
tirosina

serina cido asprtico cido glutmico

6
asparagina glicina
histidina
PROTENAS

7
PROTENAS
So polmeros de aminocidos.

Vinte tipos de aminocidos ocorrem

naturalmente nas protenas.

Diferem com o tipo, nmero e seqncia

de aminocidos na cadeia polimrica,
conformao molecular tridimensional.

Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O,

8
14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.
PROTENAS
ESTRUTURA DAS PROTENAS

ESTRUTURA PRIMRIA
Seqncia linear de aminocidos

Nvelestrutural mais importante, dele

deriva todo o arranjo espacial da
molcula

Variaem 3 aspectos: nmero, seqncia

e natureza dos AA 9
10
PROTENAS
ESTRUTURA SECUNDRIA

Disposio espacial adotada pela cadeia

polipeptdica

Estrutura helicoidal (-hlice)

interaes H intra-moleculares
Estrutura foliar (folhas pregueadas)
interaes H inter-moleculares

11
PROTENAS
ESTRUTURA TERCIRIA

Organizao tridimensional da cadeia

polipeptdica contendo ou no zonas de
estrutura secundria definidas
Estabilizao:
Ligaes dissulfeto (Cys + Cys = cistina)
interaes de hidrognio
Interaes eletrostticas
Interaes dipolares
Interaes hidrofbicas
Foras de Van der Waals
Grupos hidrofbicos dispostos no interior da
12
molcula
PROTENAS
ESTRUTURA QUATERNRIA

Resultado de associaes no covalentes de

unidades proticas iguais ou diferentes
Estas subunidades se mantm unidas por
foras covalentes, como pontes dissulfeto, e
ligaes no covalentes, como pontes de
hidrognio, interaes hidrofbicas, etc.

13
 PROTENAS NO ALIMENTO

Fonte de aminocidos na dieta e de energia.

Aminocidos essncias (lisina, triptofano,

metionina, leucina, isoleucina e valina) no

podem ser sintetizados pelo organismo humano.

Protenas alimentares so digerveis, no txicas

e palatveis. Tm diferentes estruturas

moleculares, atributos nutricionais e

14

propriedades fsico-qumicas.
 PROTENAS
Responsveis por compostos aromticos e
substncias coloridas formadas por reaes
trmicas ou enzimticas ocorridas durante
obteno, preparao e armazenamento dos
alimentos.

Componentes estruturais de muitos

alimentos naturais, freqentemente
determinam sua textura, por exemplo,
15

tenderness de produtos de carne e peixe.

 PROTENAS
Isoladas so usadas nos alimentos como
ingredientes devidos a suas propriedades
funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir
aparncia, textura ou estabilidade desejveis
ao produto: agentes gelificantes,
emulsionantes, espumantes e espessantes.

Alergias e intolerncias protenas de leite,

ovos, castanhas, etc.; celacos,
fenilcetunricos. 16
MTODOS FISICO-QUMICOS DE
DETERMINAO DE PROTENAS EM
ALIMENTOS

IMPORTNCIA

Conhecer o valor nutritivo

Determinao da composio centesimal
de um alimento e anlise para rotulagem
Estimar rendimento industrial

Avaliar a qualidade (ex.: glten

qualidade da farinha)
Avaliar a influncia nas propriedades 17

sensoriais
 MTODOS DE DETERMINAO

A. Mtodos que utilizam a determinao de Nitrognio:

Kjeldahl **
Dumas **
Destilao direta
Mtodos que utilizam tcnicas nucleares: ativao por nutrons;
ativao por prtons

B. Mtodos qumicos e fsicos

Reao do Biureto **
Interao protena-corante (Dye-binding) **
Mtodo do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Mtodo do fenol
reagente **
Titulao com formol
Espectroscopia no IV ou no UV **
Refratometria
Turbidimetria **
Espectroscopia eletrnica 18
Polarografia
Anlise de nitrognio
a determinao mais utilizada.

Considera que as protenas tm, em mdia,

16% de nitrognio.

Fator geral (F) na transformao de

nitrognio para protenas de 6,25%.

%Proteinas = F x %N

Fatores de converso especficos: trigo-

5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
19
 Protenas - Kjeldahl
Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.

No mede protenas diretamente. A

quantidade de protenas presentes
calculada a partir da concentrao de N no
alimento.

Necessita de um fator de converso (F) para

converter a medida de N para protenas.

F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g protena)

usado para muitas aplicaes, existem
20
outros fatores de converso.
KJELDAHL

o principal mtodo para determinao de

protenas em alimentos - padro e
largamente usado.

Tem alta preciso e boa reprodutibilidade.

O mtodo Kjeldahl dividido em trs

etapas: digesto, destilao e titulao.
21
 MTODO KJELDAHL
1a etapa: Digesto
O alimento colocado no frasco de digesto e ento
digerido pelo aquecimento na presena de cido sulfrico
(um agente oxidante que digere alimentos), e um
catalisador (cobre, selnio, titnio ou mercrio).
A digesto converte o N do alimento (ou outro na forma
de nitratos ou nitritos) em amnio, e a matria orgnica
em C02 e H20. O gs amnia no liberado numa soluo
cida porque a amnia est na forma de on (NH4+) que se
liga ao on sulfato (SO42-) e assim permanece na soluo:

CHON (alimento) (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g)

(1) 22
 MTODO KJELDAHL
2a etapa: Neutralizao e DESTILAO
Depois da digesto o frasco de digesto conectado no
destilador de nitrognio. Adiciona-se hidrxido de sdio, que
converte o sulfato de amnio em gs amnia:

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)

A amnia formada liberada da soluo. Por destilao por

arraste a vapor a NH3 transferida do frasco de digesto para
um erlenmeyer contendo cido brico em excesso.

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- (on borato) (3)

23
 DESTILADOR
NaOH

DIGESTOR

gua de
arraste
Erlenmeyer com
soluo de H3BO3
Amostra

24
 MTODO KJELDAHL
3a etapa: Titulao
O contedo de N estimado por titulao do borato de
amnio com cido sulfrico ou clordrico.
H2BO3- + H+ H3BO3 (4)
A concentrao dos ons H+ gastos na titulao
equivalem concentrao do nitrognio.
O contedo de N ento convertido em protenas usando
um fator apropriado:
%Protein = F x %N
25
 Falhas do processo (Kjeldahl):
1. No uma medida verdadeira de protenas,
dosa todo N - protico e no protico (purinas,
piridinas, vitaminas, uria, aminas, amidas, etc.).
Pode melhorar a tcnica precipitando a protena
e separando com lavagem (retira o N no
protico), mas, no entanto pode carregar
peptdeos e aminocidos.
3. F d erros quando o contedo em N muito
diferente de 16%. Diferentes protenas necessitam
de diferentes fatores de correo pois tem
diferentes seqncias de aminocidos
5. Desvantagem: utiliza substncias
26
corrosivas/muito oxidantes
 DESTILAO DIRETA
Modificao do mtodo de kjeldahl.

Sem digesto.

Amostra + NaOH/Na2SO4 NH3

Mistura-se com H3BO3 e titula-se com cido.

Necessita de curva de calibrao.

usado como rotina em alguns alimentos,

produtos crus (no qual o tempo mais
importante que a exatido). 27
MTODO DUMAS (1831)
Tambm determina N total.
Princpio: Combusto a 700-900C produz CO2, H2O
e N2.
Combusto da amostra Medio do
(700-800C) N gasoso

O N2 liberado analisado volumetricamente ou por

tcnica instrumental.
N2 pode ser medido quando passa atravs de uma
coluna que tem um detector de condutividade
trmica no final.
28
 MTODO DUMAS
Necessrio converter o teor de N na amostra
para teor de protenas - F.

Problemas: sujeita erros pequena qtde

de amostra amostra pode ser no
representativa.

Equipamento
- melhora preciso;

- mais rpido, uns 4-10 minutos por medida,

comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;

-- no necessita de reagentes ou catalisador.

TURBIMTRICO
Fundamento: medida da turbidez causada pela
protena precipitada. Agentes precipitantes:
c.tricloroactico, ferricianeto de potssio, cido
Sulfosaliclico.
Precipitante + protena turbidez

Mede-se o grau de turbidez.

Rpido, simples (protenas lquidas).

Desvantagens: no usado p/slidos; depende

da protena; depende de padres; precipitao de30
interferentes.
 MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS
Asprincipais diferentes entre os testes so os
grupos qumicos responsveis pela absoro da
radiao, exemplo: ligaes peptdicas, grupos
aromticos, grupos bsicos protenas
agregadas.

A concentrao de protenas determinada a

partir da curva de calibrao.

As curvas de calibrao de absorbncia (ou

turbidez) versus concentrao protenas
preparada usando uma srie de solues de31
concentrao conhecida.
 MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS UV E VISVEL

Desvantagens: necessrio que as protenas

estejam diludas em solues transparentes, e
que no contenham substncias que absorvam
no mesmo comprimento de onda que as
protenas.

Preparao de alimentos exigem muitas etapas:

homogeneizao, extrao por solventes,
centrifugao, filtrao, que podem consumir
muito tempo e trabalho.

Absorbncia depende do tipo de protena. 32

 Teste do Biureto (Riegler, 1914)

Princpio - Sais de Cu+2 em solues alcalinas

produzem cor violeta ou roxa quando interagem
com ligaes peptdicas.
Medida feita em um Colormetro ou
espectrofotmetro.
Faz-se a reao e aps uns 15-20 minutos l-se a
absorbncia a 540 nm.
Determina protenas. 33
 Cor formada depende de cada protena e a
intensidade proporcional quantidade.

34
 B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)

Reao das protenas com reagente de fenol Folin-

Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em
condies alcalinas).
Oxidao de aminocidos aromticos - tirosina e
triptofano - com aparecimento de uma colorao
azul.
Cor azul colormetro (500 a 750 nm) curva
padro.
35
B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)

Desvantagens:
lento: operaes mltiplas e perodo de incubao
Necessita de uma curva padro com protena
conhecida
Intensidade da cor depende de cada protena.

36
 C. Mtodos Espectofotomtricos UV
Princpio - protenas possuem absoro UV em
280nm (aminocidos aromticos: tirosina, triptofano,
fenilalanina.

Rpido, simples, no usa reagentes e no destrutivo.

Pouco exato - depende da composio dos
aminocidos.
37
cidos nuclicos podem interferir.
 Mtodo Dye-binding
Corantes que reagem quantitativamente com
protenas.
Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H.
Corante + protena complexo insolvel.
Mede-se o excesso de corante colorimetricamente.
A quantidade de protena :
Corante ligado = corante inicial corante livre.

Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto

bfalo e preto amino 10B.
38
DYE-BINDING

Fundamento:
Amostra Formao de Separao
+ um complexo (centrifugao
corante insolvel ou filtrao)
(exc.)

Mede o excesso
Boa correlao com o Kjeldahl. de corante que
no reagiu
Rpido, simples, exato, econmico.

Desvantagens: Por diferena obtm-

Aquisio do equipamento se a quantidade de39
protena
 SEPARAO DE PROTENAS

Solubilidade

Cromatografia:

- tamanho,
- carga,
- adsoro.

40
 ANLISE DE AMINOCIDOS
Determinar a composio de aminocidos nas
protenas.
A protena hidrolisada usando um cido
forte ou enzimas libera aminocidos.
Cromatografias separam os aminocidos
troca inica, afinidade ou por absoro.

41
42
43