AMPLIFICACIN

ENZIMTICA DEL DNA POR

REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA
PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION)
INTEGRANTES:
CISNEROS
WILLIAN
RICHARD
POLIMERASA CHAIN REACTIN:
REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
FUE DISEADA POR EL DR.
KARY MULLIS EN 1938.

GAN EL PREMIO NBEL DE

QUMICA EN 1993 POR SU
INVENTO.

UTILIZO EL PCR PARA

AMPLIFICACIN DEL GEN DE
-HEMOGLOBINA HUMANA, Y
EL DIAGNOSTICO PRENATAL
DE ANEMIA FALCIFORME.
 PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
ES LA AMPLIFICACIN DE DNA IN VITRO POR MEDIO DE LA
POLIMERIZACIN EN CADENA DE DNA UTILIZANDO UN
TERMOCICLADOR.

EL PROPSITO DEL PCR ES HACER MUCHAS COPIAS DE UN

FRAGMENTO DE DNA.

SE REALIZA LA AMPLIFICACIN DE UN SEGMENTO

ESPECFICO DE DNA, TENIENDO POCO MATERIAL
DISPONIBLE.
 TERMOCICLADOR

La PCR se realiza
en un Thermo
Cycler
Termociclador.

Es una mquina
que calienta y
enfra la reaccin
en periodos cortos
de tiempo.
 El proceso de PCR incluye 3 pasos
bsicos que se repiten 25 veces o ms:
1. DESNATURALIZACIN: CONSISTE EN SEPARAR LA DOBLE HEBRA DE DNA Y
CONVERTIRLA EN HEBRA SENCILLA.
-TPICAMENTE SE USA UNA TEMPERATURA DE 95C - 97C, POR 15 A 40 SEGUNDOS
EL TIEMPO DEPENDE DEL TAMAO DEL GENOMA.
2. APAREAMIENTO O ANNELING:

LOS CEBADORES PRIMERS PREVIAMENTE DISEADOS,

REACCIONAN CON LA HEBRA SENCILLA DE DNA Y SE
PEGAN EN LUGARES ESPECFICOS POR
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES. PARA ESTO, SE BAJA
LA TEMPERATURA -EJ: 55C POR 30 SEGUNDOS-. LA
TEMPERATURA Y EL TIEMPO PUEDE VARIAR ENTRE
CEBADORES SEGN SEA EL CASO.
3. POLIMERIZACIN O EXTENSIN.
UNA POLIMERASA DE DNA EXTIENDE LOS PRIMERS,
EN EL ESPACIO COMPRENDIDO ENTRE AMBOS
PRIMERS, Y COLOCA DINUCLEOTIDOS
TRIFOSFATADOS (DNTPS) DE 5A 3 LEYENDO EL DNA
DE 3A 5. DE ESTAS FORMA SINTETIZA LA
SECUENCIA COMPLEMENTARIA DE LAS HEBRAS DE
DNA MOLDE.
SE EFECTA A 70C POR 1 MINUTOS (PUEDE VARIAR
SEGN SEA NECESARIO.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea nec

EN EL PCR HAY UNA AMPLIFICACIN
EXPONENCIAL
 REACTIVOS NECESARIOS
PARA PCR:
AMORTIGUADOR (BUFFER): 50MM KCL, 10MM TRIS. CL
(PH 8.3 A TEMPERATURA AMBIENTE) Y 1.5 MM MGCL2.
MGCL2: PUEDE ESTAR EN FORMA DE MGCL2, MGSO4. SE
USA 25MM -ES UN COFACTOR PARA LA FUNCIN DE LA
POLIMERASA-
DNTPS (DINUCLEOTIDOS TRIFOSFATADOS): DATP,
DGTP, DCTP, DTTP.
-LA CONCENTRACIN DE DNTPS, ES PROPORCIONAL AL
TAMAO DEL FRAGMENTO QUE SE DESEA AMPLIFICAR. EJ: SI
VAMOS A AMPLIFICAR UN FRAGMENTO DE 500PB VS UNO
DE 5500 PB, NECESITAMOS MS CONCENTRACIN DE DNTPS
PARA EL DE 5500PB.
-GENERALMENTE, SE USA UNA CONCENTRACIN DE 200M DE
CADA UNO.
 REACTIVOS NECESARIOS
PARA PCR:
CEBADORES PRIMERS: SON SECUENCIAS
CORTAS DE NUCLETIDOS 20-24 NUCLETIDOS DE
LONGITUD, COMPLEMENTARIAS A UNA REGIN DEL DNA
QUE SE QUIERE AMPLIFICAR. -SE USA A CONCENTRACIN DE
1M-
DNA MOLDE: EL DNA A AMPLIFICAR PUEDE TENER DESDE
50 A 2,000 NUCLETIDOS DE LONGITUD.
EL MNIMO VA DE 10-100 NG. Y EL MXIMO ENTRE 400-500
NG.
POLIMERASA: GENERALMENTE SE USA 2 UNIDADES POR
REACCIN.
 ADYUVANTES DE LA PCR
SON ELEMENTOS QUE MEJORAN EL RENDIMIENTO Y
LA ESPECIFICIDAD DE LA PCR.

SE USA DMSO, GLICEROL O BSA.

EL ADYUVANTE MS UTILIZADO ES EL BSA. A

CONCENTRACIONES POR ENCIMA DE 0.8 G/L EL
BSA INCREMENTA LA EFICIENCIA DE LA PCR YA
ACTA COMO UNA PROTENA CAPTADORA DE
IONES QUE PUEDEN SER INHIBIDORES DE LA TAQ
POLIMERASA
Polimerasa
En un principio, la polimerasa de DNA que
se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero
esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que haba que aadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.

Se reemplazo la enzima por la de la

bacteria Thermus aquaticus conocida
como Taq pol
 ANLISIS DE LA
MUESTRA
LA DETECCIN DEL
PRODUCTO DE LA PCR SE
REALIZA NORMALMENTE
MEDIANTE CORRIDO
ELECTROFORTICO.

DEPENDIENDO DEL
TAMAO DE LA
AMPLIFICACIN Y LA
RESOLUCIN QUE
DESEEMOS UTILIZAREMOS
DIFERENTES MEDIOS
(AGAROSA,
POLIACRILAMIDA) A
DISTINTAS
CONCENTRACIONES.
 ANLISIS DE LA MUESTRA

La posterior visualizacin se puede realizar

con bromuro de etidio (lmpara de luz UV),
tincin de plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800
pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas
(primers inespecficos se
pegan a varios sitios)
SE PUEDE AMPLIFICAR DIRECTAMENTE DE:
ADN GENMICO
CDNA (RT-PCR)

APLICACIONES
Deteccin de agentes infecciosos como:
hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, anlisis de fsiles
Mutagnesis dirigida (cambios en la
informacin contenida a travs de primers
con mutaciones)
Investigacin forense
Pruebas de paternidad
APLICACIONES

Criminalstica
EJEMPLO DE UN CASO DE
CRIMINALSTICA RESUELTO
UTILIZANDO ELECTROFORESIS
EN GEL VERTICAL DE
ACRILAMIDA.

SI SE OBSERVAN LOS PATRONES

BANDAS PODR COMPROBARSE
COMO LOS PERFILES OBTENIDOS
EN LAS MANCHAS DE SANGRE
ENCONTRADAS EN EL
SOMBRERO (HAT) Y PANTALN
(JEANS) DEL SOSPECHOSO (S)
COINCIDEN CON EL PERFIL
GENTICO DE LA VCTIMA (V)
 VENTAJAS DEL PCR
A PARTIR DE UNA MUESTRA PEQUEA DE ADN SE
PUEDE OBTENER UNA CANTIDAD CONSIDERABLE PARA
EL ESTUDIO QUE SE VAYA A REALIZAR.
EL PRODUCTO SE PUEDE UTILIZAR PARA CLONAR,
SECUENCIAR Y ANLISIS.
SE PUEDE AMPLIFICAR ADN DE CUALQUIER
ORGANISMO VIVO O MUERTO.
SUS APLICACIONES SON MLTIPLES: MEDICINA
FORENSE, DIAGNSTICOS, ANLISIS PRENATALES, ETC.
 DESVENTAJAS DEL PCR
SE PUEDE REPRODUCIR SOLAMENTE PARTES DEL GENOMA EN
DONDE SE CONOCE POR LO MENOS UNA MNIMA SECUENCIA
DE 20 40 PB.
SE NECESITAN PRIMERS ESPECFICOS QUE SEAN
COMPLEMENTARIOS AL FRAGMENTO QUE SE DESEA
SINTETIZAR.
LA POLIMERIZACIN PUEDE TENER ERRORES AL SINTETIZAR
EL ADN
PUEDE CONTAMINARSE CON OTRO ADN (PUEDE SER DEL
MISMO INVESTIGADOR O DE CUALQUIER OTRO.
 MATERIALES PARA PCR

ADN MOLDE (ADN EN ESTUDIO)

TERMOCICLADOR THERMO
CYCLER PRIMER FORWARD Y REVERSE

MICROCENTRFUGA DNTPS (DATP, DTTP, DCTP,

DGTP DE [25 M] C/U)
MICROPIPETAS DE 2, 20 Y 200
UL 10X BUFFER PARA PCR
(SOLUCIN AMORTIGUADORA
MICROTUBOS PARA PCR,
PARA PCR)
ESTRILES
MGCL2 (25 MM)
PUNTAS ESTRILES
BSA
AGUA DESTILADA,
DESIONIZADA Y ESTRIL POLIMERASA TAQ
 PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIN DEL
DNA GENMICO (PREVIAMENTE REALIZADO)
SE REALIZ UN FROTIS BUCAL
EL CONTENIDO DEL HISOPO SWAB SE RESUSPENDE EN 1000UL DE
NACL 0.9%
CENTRIFUGAR POR 5 MINUTOS A 7K
DESCARTA SOBRENADANTE
RESUSPENDER EL PRECIPITADO PELLET EN 500UL DE CHELEX AL 10%
INCUBAR A 100C POR 20 MINUTOS
CENTRIFUGAR POR 5 MINUTOS A 7K
TOMAR EL SOBRENADANTE ( DNA EN SOLUCIN)
DEJAR LA MUESTRA A -20 GRADOS HASTA CUANDO SE VA A TRABAJAR
CON ELLA
NOTA: EL CHELEX ACTA COMO AGENTE DESESTABILIZADOR DE MEMBRANAS Y QUELANTE.
 CONDICIONES PARA REACCIN EN EL
TERMOCICLADOR:
1 CICLO : 94C POR 2.5 MINUTOS.
32 CICLOS: 94 C POR 30 SEGUNDOS
54 C POR 1 MINUTOS
72 C POR 70 SEGUNDOS
1 CICLO: 72 C POR 10 MINUTOS

LLEVE A REACCIONAR EN EL
TERMOCICLADOR.
 GRACIAS
POR SU ATENCIN
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