ENZIMAS

II
BIOCATALIZADORES

1
 La funcin de un catalizador es aumentar la velocidad de una
reaccin.
Los catalizadores no modifican los equilibrios de reaccin.

El equilibrio entre S y P refleja la diferencia en energa libre de sus

estados basales.
La energa libre del estado basal de P es inferior a la de S, por lo que
G10 de la reaccin es negativo (la reaccin es exotrmica) y en el
equilibrio hay ms P que S (el equilibrio favorece a P). 2
La posicin y la direccin de este equilibrio no estn
afectadas por ningn catalizador.
Un equilibrio favorable, no indica que la conversin
de S P tenga lugar a una velocidad detectable.
La velocidad de una reaccin depende de un parmetro
totalmente diferente.
Existe una barrera energtica
entre S y P que representa la
energa requerida para :
el alineamiento de los grupos
reactivos,
La formacin de cargas transitorias
inestables,
Los reordenamientos de enlaces
Otras transformaciones que se
requieren para que la reaccin
Para que haya reaccin, lastenga
molculas
lugar enhan de superar
cualquiera de las
esta barrera, por lo que deben llegar a un nivel
dos direcciones. 3
 En la parte superior de la colina energtica existe un
punto en el que la cada hacia el estado de "S" o "P"
es igualmente probable (en los dos casos, el camino
es de bajada). Es lo que se denomina el estado de
transicin.
El estado de transicin:
no es una especie qumica con estabilidad significativa.
Es un momento molecular fugaz en el que
acontecimientos tales como:
Rotura de enlace
Formacin de enlaces
Desarrollo de cargas,
han llegado al momento preciso en el que el colapso
hacia sustrato o producto es igualmente probable.

Estado de transicin

4
Energa de activacin G: es la diferencia de energa
entre el estado basal y el estado de transicin.
La velocidad de una reaccin refleja sta energa de
activacin
Energa de activacin elevada corresponde una
reaccin lenta.
Reaccin ms lenta

Reaccin ms rpida

Las velocidades de reaccin pueden aumentarse

incrementando la temperatura y/o la presin que
aumentan el nmero de molculas con energa suficiente
5
De modo alternativo, es posible disminuir la energa
de activacin mediante un catalizador.
Los enzimas no modifican el equilibrio de la reaccin,
su papel es acelerar la interconversin de S y P,
no se gasta enzima en el proceso y
el punto de equilibrio no queda afectado.

Sin embargo, la reaccin alcanza el equilibrio de

una manera mucho ms rpida cuando se haya
presente el enzima adecuado ya que incrementa
la velocidad de la reaccin.

6
 C12H22O11 + 12O2 12CO2 + 11H2O

La reaccin tiene un G muy grande y negativo:

Termodinmicamente Favorable
Exotermica
La cantidad de sustrato presente en el equilibrio es desprec
la sacarosa en un compuesto muy estable ya que la
barrera de activacin energtica que debe superar antes
de reaccionar con el oxigeno es muy alta.
Las enzimas no solo aceleran las reacciones:
las organizan y
controlan
de tal manera que gran parte de la energa liberada
en el proceso se recupera en otras formas qumicas
accesibles a la clula para que realice sus funciones.
7
 Intermediario de reaccin:
Especie producida en el transcurso de la reaccin
que tenga un tiempo de vida qumico finito (y mayor
que el de una vibracin molecular, ~10-12 segundos)

Cuando la reaccin
S P

Est catalizada por un enzima

Los complejos ES y EP pueden ser considerados

intermediarios a pesar de que S y P sean especies
qumicas estables
os complejos ES y EP ocupan vallen en el diagrama de reacci

8
9
 A B C D E
Cuando en una reaccin existen varios pasos, la
velocidad global viene determinada por el paso (o
pasos) cuya energa de activacin sea ms
elevada. A este paso se le llama paso limitante
de velocidad.
El paso limitante de velocidad puede cambiar
con las condiciones de reaccin y en el caso de
muchos enzimas puede haber varios pasos con
energa de activacin similares.

10
Las energas de activacin son barreras
energticas para las reacciones qumicas,
estas barreras son cruciales para la propia
vida. La velocidad a la que una molcula se
transforma en una reaccin qumica desciende
al aumentar la barrera de activacin.
Sin estas barreras energticas, las
macromolculas complejas revertiran a
formas moleculares mucho ms sencillas y no
podran existir las estructuras complejas y
altamente ordenadas ni los procesos
metablicos que tiene lugar en la clula.
11
 Parmetro Definicin
termodinmica
Equilibrio de Variacin de la energa G0
reaccin libre estndar de la
reaccin
Velocidad de Energa de activacin G
Un equilibrio de la forma
reaccin
S P
est descrito por una constante de equilibrio, keq, o K

En las condiciones estndar utilizadas para comparar los

procesos bioqumicos, una constante de equilibrio se
denota por keq (o K):

12
a relacin que guardan Keq y G0 puede describirse

Constante de los gasesTemperatura

(8.315 J/mol.K) absoluta 298 K
(25C)

Un valor negativo grande de G0 refleja un equilibrio

de reaccin favorable (la cantidad de producto en el
equilibrio es mucho mayor que la de sustrato), este
hecho no significa que la reaccin transcurra a una
velocidad conveniente para la clula.

13
La velocidad de una reaccin est determinada por la
concentracin de reactivo (o reactivos) y por una
constante de velocidad general k.
Tipo de Reaccin Ecuacin de Unidades
reaccin velocidad
1er orden unimolecular S-1

2do orden concentracin M-1S-1

de dos
compuestos

K es una constante de proporcionalidad que refleja la

probabilidad de reaccin bajo un conjunto de condiciones
(pH, temperatura, etc.)
Ejemplo:
Si una reaccin de primer orden tiene una constante de velocidad
k=0.03S-1 se puede interpretar cualitativamente:
3% de sustrato accesible ser convertido en P en 1s.
14
 Constante Constante
de de Plank
Boltzmann

Los aumentos de velocidad conseguidos por los enzimas son de

5 a 17 rdenes de magnitud

Anhidrasa carbnica 107

Carboxipeptidasa A 1011
Fosfoglucomutasa 1012
Ureasa 1014

15
 Los enzimas son tambin muy especficos,
discriminando fcilmente entre sustratos con
estructuras muydesimilares
Reordenamiento los enlaces covalentes durante una reaccin
catalizada por enzimas entre sustratos y grupos funcionales de los
enzimas (los grupos funcionales catalticos de las enzimas pueden
formar enlaces covalentes transitorios con un sustrato, activndolo
para la reaccin, o bien transferirse momentneamente un grupo
del sustrato al enzima.
Interaccin no covalente entre el enzima y el sustrato 16
La interaccin entre la enzima y el sustrato en el
complejo ES, est mediada por las mismas fuerzas que
estabilizan la estructura proteica:
Puentes de hidrgeno
Interacciones hidrofbicas
Interacciones inicas
Fuerzas de Van del Waals

El establecimiento de cada interaccin dbil en el

complejo ES se asocia a una liberacin de una pequea
cantidad de energa libre que estabiliza la interaccin.

Energa de fijacin GB: la energa procedente de la

interaccin enzima-sustrato.

Es la primera fuente de energa libre utilizada por las

enzimas para disminuir su energa de activacin de las
reacciones 17
 PRINCIPIOS FUNDAMENTALES DE LA
CATLISIS ENZIMTICA

1.- la mayor parte del poder cataltico de las enzimas procede

de la energa libre emitida al formarse los mltiples
enlaces dbiles e interacciones entre un enzima y su
sustrato. Esta energa de fijacin contribuye tanto a la
especificidad como a la catlisis.

2.- las interacciones dbiles estn optimizadas en el estado de

transicin de la reaccin. Los sitios activos de las enzimas son
complementarios no a los sustratos per se, sino a los estados
de transicin a travs de los que pasan los sustratos al ser
convertidos en productos durante una reaccin enzimtica.

18
 LAS INTERACCIONES DBILES ENTRE
ENZIMAS Y SUSTRATOS SON OPTIMAS EN EL
ESTADO DE TRANSICIN

19
 Especificidad: se refiere a la capacidad de un
enzima de discriminar entre sus sustratos y una
molcula competitiva.
Factores fsicos y termodinmicos que contribuyen al
valor de G, la barrera para una reaccin:
La entropa (libertad de movimiento) de las
molculas en solucin, que reducen la posibilidad
de que reaccionen entre ellas.
La capa de solvatacin del agua unida por puentes
de hidrgeno que rodea y ayuda a estabilizar
muchas biomolculas en disolucin acuosa.
La distorsin de los sustratos que ha de tener lugar
en muchas reacciones
La necesidad de conseguir un alineamiento
adecuado de los grupos funcionales catalticos en el
enzima.

Se utiliza la energa de fijacin para superar todas estas

20
Reduccin de la entropa: es uno de los
beneficios obvios de la fijacin del sustrato a la
enzima.

Desolvatacin del sustrato: Interacciones

enzima-sustrato reemplazan la mayora de o
incluso todos los enlaces de hidrgeno que
puedan existir entre el sustrato y el agua.

Encaje inducido: cambio conformacional que

experimenta el enzima cuando se fija al
sustrato inducido por mltiples interacciones
21
ESTRATEGIAS CATALTICAS REALIZADAS POR
LAS ENZIMAS

Catlisis cido-base general

Catlisis cido-base especfica
Catlisis covalente
Catlisis por iones metlicos

La mayora de las enzimas utilizan una

combinacin de varias estrategias para
conseguir un incremento en la velocidad.

22
 CINTICA ENZIMTICA

Consiste en la determinacin de la velocidad de

la reaccin y del modo en que esta cambia en
respuesta a cambios en los parmetros
experimentales
Uno de los factores claves que afectan la velocidad
de una reaccin catalizada por una enzima es la
concentracin de sustrato presente [S].

El estudio de los efectos de la concentracin de

sustrato es complicado porque [S] cambia durante
el transcurso de una reaccin in vitro a medida que
el sustrato se convierte en producto.

Una estrategia para sortear este inconveniente es

la determinacin de la velocidad inicial V0. 23
En una reaccin tpica, la enzima puede estar presente en
concentraciones del orden nano molar, mientras que [S]
puede ser cinco o seis ordenes de magnitud mayor.

Si slo se toman datos del inicio de la reaccin (los

primeros sesenta segundos o menos), los cambios en [S]
se limitan a un pequeo porcentaje y puede considerarse
que la concentracin permanece constante.

Despus puede explorarse el valor de V0 en funcin de [S]

[S] V0
[S1]

[S2]

[S3]

[S4]

24
 CURVA DE SATURACIN

A concentraciones de sustrato bajas, V0 aumenta casi

linealmente con el incremento de [S]
A mayores concentraciones de sustrato, V0 aumenta
a incrementos cada vez menores en respuesta a
incrementos [S]. Finalmente, se alcanza un punto
ms all del cual se dan incrementos pequesimos
de V a medida que aumenta [S]. Esta meseta se 25
La enzima se combina de
forma reversible con su k1
sustrato formando un E + S ES
complejo enzima-sustrato K-1
en un paso reversible
El complejo enzima-
relativamente rpido:
k2 sustrato se descompone
ES E + P en un segundo paso mas
K-2 lento dando el enzima
libre y el producto de la
reaccin P:
Puesto que la segunda reaccin es ms lenta, limita la velocidad de
reaccin global, que es proporcional a la concentracin de la especie
que reacciona en el segundo paso, es decir ES. 26
 La enzima involucrada en una reaccin podemos
encontrarla en cualquier momento en dos formas:

E, la forma libre o sin combinar

ES, la forma combinada
[S], la mayor parte del enzima est en la forma libre.
La velocidad inicial mxima de la reaccin catalizada
V(max) se observar cuando la mayor parte de la
enzima est en forma de enzima-sustrato ES y la
concentracin de E sea extremadamente pequea.

En estas condiciones la enzima est saturada con su

sustrato, por los que un aumento en la concentracin del
sustrato [S] no tendr efecto sobre la velocidad. 27
 La curva de V0 vs [S] de la mayora de las enzimas
presenta la misma forma.

Se puede expresar algebraicamente mediante la

ecuacin de Michaelis-Menten.

Velocidad inicial
Velocidad mxima
Concentracin del sustrato
Constante de Michaelis

os estos trminos se pueden medir fcilmente de manera experimental.

28
Asumiendo la existencia del estado estacionario

En los primeros momentos de la reaccin, la

concentracin del producto, [P], es despreciable y puede
ignorarse la reaccin inversa PS (descrita por k2).

k1 k2
E + S ES E + P
K-1

V0 est determinada por la descomposicin de ES para

dar producto, esta determinada por [ES]
V0=k2[ES] No la podemos medir
experimentalmente con
facilidad

29
= [E] + [ES] la suma de la enzima libre mas la enzima unida al sustrat

Por lo que [E] =[ET] - [ES]

[S] >>>> [ET]

La cantidad de sustrato fijada por el enzima en cualquier

momento de la reaccin es despreciable comparado con la
[S]
Velocidad de formacin de ES=k1([ET] - [ES]) [S]

Velocidad de descomposicin de ES=k-1 [ES] + k2[ES]

HIPTESIS DEL ESTADO ESTACIONARIO

La velocidad inicial de reaccin refleja un estado estacionario en

el que [ES] es constante, es decir, la velocidad de formacin de
ES es igual a la velocidad de descomposicin

30
k1([ET] - [ES]) [S] =k-1 [ES] + k2[ES] resolvemos en
funcin de [ES]
k1[ET] [S] - k1 [ES] [S] = (k-1 + k2 )[ES]

k1[ET] [S] = (k1[S] + k-1 + k2 )[ES]

Constante de Michaelis, Km

Sustituimos en V0=k2[ES]
31


La velocidad mxima se obtendr cuando el enzima est

saturado: [ES]=[ET]

Vmax se puede definir como k2[Et]

Ecuacin de velocidad de Michaelis-Menten

Km tiene unidades
de concentracin
molar

Km es equivalente a la concentracin de sustrato a la cual V 0 es la mitad de32Vmax.

 GRFICA DE LOS DOBLES RECPROCOS

Procedimiento ms prctico para la obtencin de la Km.

Tomamos los inversos de ambos lados de la ecuacin

Separamos los componentes

Simplificando

33
 Ecuacin de Lineweaver-Burk

34
 INCREMENTO DE LA VELOCIDAD POR LA UREASA
1.- La ureasa aumenta la velocidad de hidrlisis de la urea a pH
8.0 y 20C en un factor de 1014. Si una cantidad dada de ureasa
puede hidrolizar completamente una cantidad determinada de
urea en 5 min a 20C y pH 8.0, Cunto tardar en hidrolizarse
esta cantidad de urea en las mismas condiciones pero en
ausencia de ureasa? Suponga que ambas reacciones tienen
lugar en sistemas estriles de modo que las bacterias no
pueden atacar la urea.

R= 5 X 1014. min

35
 INCREMENTO DE LA VELOCIDAD POR LA UREASA
2.- Calcule el valor de Vmax y Km de la reaccin catalizada
enzimticamente para la que se obtuvieron los datos
siguientes:

V0 1/V0
[S] 1/[S]
(M/min
(M)
) 0.035714
400000 29
2.5 X10-6 28
250000 0.025
4.0 X10-6 40
0.014285
1 X10-5 70 100000 71
2 X10-5 95 0.010526
4 X10-5 112 50000 32
0.008928
1 X10-4 128
25000 57
2 X10 -3
139
0.007812
1 X10-2 140 10000 5
0.007194
500 24 36
 4.00E-02
3.50E-02
f(x) = 0x + 0.01
3.00E-02 R = 1

2.50E-02

2.00E-02

1/0
1.50E-02

1.00E-02

5.00E-03

0.00E+00

0.00E+001.00E+052.00E+053.00E+054.00E+055.00E+05
1/[]

es la velocidad alcanzada cuando todo el enzima se encuentra como E

ax
es la concentracin de sustrato a la cual la V0 es de la Vmax.
37