Tcnicas de Pipeteo y unidad PLT

Sistemas de pipeteo y dosificacin

En la actualidad, requerimos de herramientas que nos

ayuden a pipetear volmenes muy pequeos, incluso en el
rango de 0,1 a 1.0 microlitro.

Pipetear estos rangos de volmenes, es una parte esencial

de un AMPLIO CAMPO DE APLICACIONES.

Afortunadamente, contamos con una gama extraordinaria de

sistemas de pipeteo en el mercado, incluyendo pipetas de
cojn de aire y desplazamiento positivo, sistemas manuales
y electrnicos, as como micropipetas monocanales
multicanales. Pipeteo directo o pipeteo inverso
Se entiende como resultado a la consecuencia final de una serie de
acciones o eventos, expresados cualitativa o cuantitativamente.

El no alcanzar estos resultados, puede indicar que las acciones son

ineficientes o defectuosas.

De ah la importancia de la disciplina, hbitos y cultura al dar

seguimiento a un procedimiento para obtener dichos resultados.
 sigo los procedimientos al
pie de la letra?

material esta
en condiciones
adecuadas para
llevar a cabo mi
trabajo?
Cul es la mejor alternativa?
 Medicin de volmenes

La medicin de volmenes es de importancia esencial en los

laboratorios.

1.- El usuario tiene que aclarar con qu exactitud han de

efectuarse las mediciones individuales.

2.- El usuario puede elegir el tipo de aparato a utilizar en el

caso concreto de medicin.

Mediciones exactas exigen aparatos de medicin exactos y un

manejo correcto.
 Las Buenas Prcticas de Laboratorio son
procedimientos de organizacin y trabajo, bajo las
cuales los estudios se planifican, realizan, controlan,
registran e informan.

Su OBJETIVO: es asegurar la calidad e integridad

de todos los datos obtenidos durante un estudio
determinado y tambin reforzar la seguridad.

Promulgadas por OCDE (Organizacin de Cooperacin y Desarrollo Econmicos)

FDA (Food and Drug Administration)
 Buenas Prcticas
de Laboratorio

Elemento: Aparatos, materiales y reactivos

Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y

calibrados peridicamente, siguiendo procedimientos
normalizados de trabajo, para obtener resultados
confiables.
 Pipetas

Pipetas con Pipetas de desplazamiento

cojn de aire positivo
 Pipetas con cojn de aire -
Pipetas de desplazamiento

1. Con cojn de aire

No hay contacto directo entre el pistn

Y el lquido (interfase de aire).
Recomendado donde no se permite ningn
arrastre, como con medios infecciosos o
radioactivos

2. Desplazamiento positivo

El piston tiene contacto directo con el

Lquido aspirado.
El mbolo movible perfectamente ajustado a los
1. 2. capilares, deja siempre limpias las paredes de los
mismos.
El desplazamiento directo permite trabajar sin
contaminaciones, puesto que no se forman aerosoles

Donde pipetas con cojn de aire
llegan a lmites naturales, destaca el
valor de la pipeta Transferpettor.
Pipeta de desplazamiento
directo.
Dos diferentes tipos de
Transferpettor (digital y fijo)
ideal para lquidos criticos y
suspensiones
Transferpettor
densidad: 13,6 g/cm mx.
viscosidad: 50000 mm/s mx.
(dependiendo del tamao de pipeta)
presin de vapor: 500 mbar mx.
Rango de temperatura de trabajo permitido:
15 C a 40 C
Limitaciones de uso
La cristalizacin de soluciones salinas concentradas y
otros lquidos que cristalicen pueden daar el mbolo.
 Transferpettor

- Ideal para pipetear lquidos de alta

viscosidad y medios de alta densidad
(soluciones protenicas, aceites, resinas,
grasas, glicerina, mercurio, cido sulfrico).
- Medios que tiendan a producir espuma
(tensoactivos).
- Medios de alta presin de vapor (alcoholes,
ter, hidrocarburos).

No es necesario cambiar la punta despus de

cada pipeteado, ya que el residuo en las
paredes de la punta es mnimo.
Pipetas de cojn de aire
Modelos de Micropipetas
con cojn de aire
 Operacin de una
micropipeta de cojn de aire

Posicin de descanso Posicin de descanso

1er tope
1er tope
2do tope

Presionar
tecla de
expulsin

El pistn
se mueve Soplar
para
abajo Expulsor de
El pistn puntas se
se mueve mueve hacia
para abajo
abajo

No colocar nunca el aparato con la punta llena en posicin horizontal! Ya que introducira el liquido en el interior del mismo y
puede contaminarlo.
 Tcnicas de pipeteo directo

a) Presionar el botn de b). Dispensar el lquido

pipeteado hasta el primer presionando el botn de
tope. Sumergir la punta 2-3 pipeteado hasta el segundo
mm en el lquido. Aspirar el tope. La punta debe tener
lquido soltando el botn contacto con la pared del
lentamente. recipiente.

Gamma de ajuste Profundidad de inmersin en mm

0,1 l - 1 l 1 2 mm
> 1 l - 100 l 2 - 3 mm
> 100 l - 1000 l 2 - 4 mm
> 1000 l 3 - 6 mm

Se recomienda su uso para:

Soluciones estndar como: agua, buffer, soluciones alcalinas diluidas y
cidos y bases diluidos.
 Tcnicas de pipeteo inverso

a) Presionar el botn de pipeteado b) Presionar el botn hasta el

hasta el segundo tope. Sumergir la primer tope. Queda lquido en la
punta 2-3 mm en el lquido. Aspirar el punta.
lquido soltando el boton. Se aspira
un volumen mayor al mostrado en el
indicador de volumen.

Se recomienda su uso para: soluciones viscosas, soluciones

con una elevada presin de vapor.

Al suministrar lquidos con alta presin de vapor es preferible

utilizar un sistema de desplazamiento directo en lugar de
pipeteo inverso
 Puntos importantes

El lquido debe ser aspirado lento y suavemente.

Presionar el primer tope siempre con la misma fuerza

Cuando el lquido sea aspirando, la punta debe sumergirse solo

unos mm

igualdad de temperatura de la pipeta y del lquido

sostener la pipeta verticalmente al aspirar

usar puntas originales o adecuadas para la micropipeta

humedecer las puntas 5 veces

 En que casos podemos utilizar
una micropipeta electrnica?

Se obtiene mayor precicin ya que el primer

tope es siempre igual

Reduccin de fuerzas
Fuerza requerida para colocar la punta.
Fuerzas para aspirar y dispensar el lquido
Fuerza para soplar
Fuerza requerida para expulsar la punta

En Biotecnologa por:
Reduccin en el volumen de la muestra
Incremento en el nmero de muestras procesadas

Trabajo con diversas tcnicas de dosificacin

 Micropipetas electrnicas

Pipetear (Modo PIP)

Se aspira un volumen ajustado previamente y se vuelve a
soltar

Mezclar muestras (Modo PIPmix)

Programa para mezclar lquidos. Una muestra se
aspira y expulsa repetidamente y aparece en el
display el nmero de ciclos.

Pipeteado inverso (Modo revPIP)

Programa especial para pipetear lquidos
de gran viscosidad, alta
presin de vapor o medios espumosos.

Pipetear en electroforesis (Modo GEL)

Programa para cargar geles en electroforesis. Un volumen
de muestra variable se aspira a una gran velocidad
modificable y se vuelve a soltar muy lentamente.

Dispensar (Modo DISP)

Programa para dispensar lquidos. Un volumen aspirado se
vuelve a soltar parcialmente en pasos.
 Influencia en el ngulo de
inclinacin

Ejemplo:

Para una pipeta 100 l con un ngulo de inclinacin 60

-> DV = + 0,53 l (teorticamente)

+ 0,54 l (experimento)
 Influencia en el uso de
puntas diferentes

4 pipetas diferentes de 200 l (A D)

Volumen despedido

Puntas originales (A, B, C, D) y de otros

fabricantes (X, Y, Z)

falta de hermeticidad

Tipo de pipeta
 Calidad de las puntas

1. Igualdad de lote a lote

2. Hermeticidad del sistema punta/pipeta

3. Calidad de la superficie
rebadas

4. Calidad de la materia prima

5. Influencia de los aditivos en la materia prima

 Puntas de Pipeta

Para los laboratorios es crucial que las puntas que se utilizan para
transferir muestras lquidas no generen datos que resulten ser falsos
positivos o falsos negativos.

Hay una regla muy sencilla en cuanto a las tcnicas de manipulacin

de lquidos para evitar la contaminacin cruzada de un experimento a
otro.
Usar puntas nuevas para cada muestra, control o reactivo. NO
RECICLAR.

Utilice puntas con filtro para eliminar la posibilidad de que los

aerosoles con contaminante, traspasen la punta y se introduzcan en el
cuerpo de la pipeta.
 Puntas de Pipeta

Rango
nano-cap 0.1 - 20 l
Punta cristal 0.5 - 20 l
Punta neutra 1.0 50 l
Punta amarilla 2.0 - 200 l
Punta neutra 5.0 - 300 l
Punta azul 50 - 1000 l
Punta neutra 500 - 5000 l
Punta neutra 1000 -10000 l
Puntas de pipeta con filtro
Autoclavable

Para el empleo en la tcnica PCR y

para el trabajo en los campos de la
microbiologa y la radioactividad.

Filtro de PE-hidrofbo que funciona

como una barrera contra aerosoles que
se forman durante el pipeteado.

Protegen los vstagos contra la

contaminacin.

Esterilizables en autoclave.
 Todas las puntas y
puntas con filtro de
hasta 1.000 l son:

libres de ADN
Libres de Rnasa
Libre de endotoxinas
Libre ATP

Productos BIO-CERT
tambin son estriles.
 Contaminacin

Tenemos 3 fuentes principales de contaminacin en nuestro sistema

micropipeta-punta:

De la micropipeta a la muestra

De la muestra a la micropipeta

De muestra a muestra

Contaminacin
va aerosol
 Limpieza y descontaminacin

Autoclavable a 121 C (2 bares) y con un tiempo de exposicin de

como mnimo 15 minutos segn DIN EN 285.

Las micropipetas totalmente autoclavables deben:

autoclavarse sin punta

fijar el control de volumen en un punto fijo, nunca entre 2
volumenes
Con el protector de cambio de volumen totalmente desbloqueado
(UNLOCK).
Dejar que la micropipeta se enfrie y seque completamente
Despus del autoclavado apretar la conexin roscada entre la
empuadura y el vstago de la pipeta.
Balanzas
Tolerancias
ISO 8655
 ISO 8655

Volumen a verificar.

1. Volumen nominal

2. 50% del volumen nominal

3. 10 % del volumen nominal

10 mediciones
 Calibracin
de pipetas

Condiciones de ensayo
Identificacin de la pipeta Calibracin
Igualdad de temperatura 1. Acondicionar la pipeta
Temperatura entre 15C y 30C 2. Usar una punta nueva
Temperatura constante 0,5C 3. Tarar el recipiente de
pesar
Termmetro 0,5C
4. Humedecer la punta una
Balanza con una precisin diez
vez
veces mejor que la tolerancia de
la pipeta 5. Aspirar el agua sujetando
la pipeta verticalmente y
Humedad mayor de 50%
sumergiendo la punta 2 -
3 mm
6. Escurrir la pipeta a lo
largo de 8 - 10 mm
Ensayo en 100%, 50 %; 10 % en la pared del
Evaluacin y documentacin recipiente
7. Repetir 9 veces.
 Calibracin

- Usar
puntas originales o puntas comprobadas
(examinacin de la hermeticidad)

- Acoplar la punta girndola

- Al trabajar con volumenes pequeos esperar 10 s

despus de acoplar la punta

- Tiempo de espera: 1 s
Faktor Z [l/mg]

34
 Que tan frecuentemente verificamos los
instrumentos de medicin?

Los instrumentos de medicin deben ser verificados en

intervalos de tiempo regulares.

Nosotros recomendamos entre 3 y 12 meses para

instrumentos de manejo de lquidos.

Control de medios de anlisis :

La frecuencia depende segn la ISO 10012 del tiempo de

uso y de la intensidad de uso.

La periodicidad debe de adaptarse a las exigencias

individuales.
 BPL

Los aparatos deben de ser examinados, limpiados y

calibrados peridicamente, siguiendo procedimientos
normalizados de trabajo .

La frecuencia para la calibracin, revalidacin y prueba,

depende del instrumento en s, de las recomendaciones
de los fabricantes , de la experiencia del laboratorio y de
la frecuencia de uso del aparato.
 pero.

Cada certificado representa el RESULTADO de una

calibracin unicamente a un tiempo especfico
 Saba Ud.?

La mayoria de las pipetas, independientemente del

fabricante, fallan con el paso del tiempo?

~ 95 % de las fallas estan relacionadas al goteo del sistema

de pipeteado, que conduce a la aspiracin de volumenes
menores!

Ajustar la pipeta no resuelve el problema!

Las fallas generalmente ocurren entre los intervalos de

calibracin.
 Saba Ud.?

Fallas tpicas de las pipetas de cojn de aire

 Fugas no detectadas o
dificiles de detectar:
Resultados cuestionables.

Perdida de tiempo para identificar la causa del error

durante la calibracin y el rechazo de la pipeta al terminar la
calibracin.

Seleccin de intervalos cortos de calibracin para asegurar

el buen funcionamiento de las pipetas

Incremento de los costos, debido a los intervalos cortos de

calibracin.
 Unidad PLT

La unidad PLT no reemplaza la

prueba gravimetrica peridica,
pero asegura los perodos entre
las calibraciones, mediante el
control diario de las pipetas.

El aparato detecta incluso las

fugas ms pequeas.

De esta forma, la seguridad operativa

de las pipetas mejora decisivamente.
 Con o sin puntas?

Verificacin CON o SIN punta de pipeta?

Para verificar todo el sistema de pipeteado (completo),

recomendamos realizar la prueba CON punta Y QUE STA SEA
NUEVA .

Cuando una fuga ha sido identificada, la prueba se vuelve a

realizar SIN la punta para determinar en que parte est
localizada la fuga (en la zona de acoplamiento de la punta o en
la punta misma)
 Unidad PLT
tapn
Adaptador
monocanal
Pantalla

Tecla de
inicio/confirmacin

Botn de
ajuste

Tecla
Indicador LED retroceder
 Adaptadores

Adaptador monocanal Adaptador monocanal

Para pipetas con punta para pipetas sin punta

Adaptador multicanal para Filtro PE en adaptadores

pipetas con y sin punta mono y multicanal (para
proteger el aparato contra
humedad o suciedad).
 Resultados

Los valores lmite para la verificacin , representan un

lmite de advertencia!
Los lmites de advertencia de todas las pipetas se
almacenan.

Si el lmite de advertencia es alcanzado (La pantalla

muestra FALLA y hay una luz roja parpadenate, el volumen
faltante es detectable gravimetricamente.

Este es el caso a partir de de tolerancia de volumen

segn la ISO 8655-2

Cuando la pipeta esta limpia, mecanicamente libre de

error y pasa la prueba en la unidad PLT significa que el
aparato esta dentro de las tolerancias de la norma ISO
8655-2.

Lmite
 Resultados

a) La barra ha sido completada en su totalidad hasta abajo: La pipeta es hermtica

b) La barra ha sido completada desde arriba, slo hasta el sector de la marca de valor
lmite. Recomendamos realizar un ensayo gravimtrico.

c) El llenado de la barra finaliza claramente por arriba de la marca de valor lmite: La

pipeta no es hermtica. Debe hacerse un ensayo gravimtrico, y de ser
necesario, la pipeta se debe enviar a reparacin.
Muchas gracias por
Su atencin!