Etapa pre analtica

Antes de iniciar el estudio de la muestra , se debe conocer

algunos datos concernientes al paciente:

Edad
Gnero
Factores Predisponentes
Sntomas
Antecedentes de ITU
Tratamiento actual o previo con antibiticos
Recomendaciones previas para la muestra

Mujeres:
Hombres:
Se debe higienizar la zona genital
Se debe retraer el prepucio e
con agua y jabn, de adelante hacia
higienizar el glande y surco
atrs, secarse con toalla limpia, se
balano prepucial con agua y
deben colocar un tapn vaginal
jabn(no usar antispticos).
(torunda de gasa o algodn) y se
recomienda orinar separando los
labios mayores.
 Obtencin de muestra
Tipo de muestra

Mtodo Invasivo Mtodo no Invasivo

Puncin supra Cateterizacin Bolsa Sonda

pbica Chorro medio
vesical recolectora urinaria
 PROCESO ANALTICO DE CULTIVO DE ORINA
FASE ANALITICA
Medios de cultivo
Agar Sangre ,A. Macconkey
Agar chocolate: Orina de rin o muestras colectadas quirrgicamente por cistoscopia.
Medios cromognicos permite la deteccin rpida de los uropatgenos ms comunes, infecciones
mixtas y hongos.

Mtodo del Asa: Uso de nicrom o plstico.

Tamaos
Asa 1 ul recuento de colonias mayores de 1,000 UFC/ml.
Asa 10 ul recuento de colonias entre 100 y 1,000 UFC/ml.

Mtodo de la micropipeta
Usar una micropipeta calibrada de 1 a 10 ul
Puntas de pipetas estriles

Comentario. Utilizar micropipetas diferentes para cada volumen, porque ir de un extremo al otro del
rango, tiende a descalibrar el instrumento.
 PROCEDIMIENTO
Examen directo
Colocar 10 ul de orina bien mezclada sin centrifugar sobre una lmina portaobjetos, colocar un
cubreobjetos y observar a 40x
La presencia de ms de 5 leucocitos por campo es considerado como indicativo de piuria.

Nota: este resultado tiene una especificidad de 90% para predecir una infeccin urinaria asociada a catter
con ms de 105 UFC/mL, pero una sensibilidad de solo 37%.

Coloracin de Gram:
Colocar 10 ul de orina bien mezclada sin centrifugar sobre una lmina portaobjetos, y deje que se seque al
aire sin extenderla.
Determinar el nmero de organismos por campo de aceite de inmersin. Un organismo observado a
1,000x correlaciona con un recuento de colonias de 105/ml de orina.

Comentario: La tincin de Gram determina rpidamente el tipo y el recuento de bacterias y clulas en la

orina.
La presencia de una bacteria/campo de inmersin tiene buena correlacin con 100.000 UFC/ml en
85% de los casos.
La presencia de muchas clulas epiteliales y morfotipos microbianos diferentes sugieren contaminacin.
Mtodos de cultivo
Agar Sangre y Agar Macconkey medio enriquecido.

Orinas de chorro medio, recolector y catter, las muestras deben se sembrarse con asa de 1 ul. El
desarrollo de una colonia en el cultivo debe multiplicarse por 1000.
Para orinas obtenidas por cateterizacin vesical, las muestras pueden sembrarse con asa de 10ul(1colonia
= 100 ufc/ml) y 1 ul (1 colonia = 1000 ufc/ml).

Comentario: El recuento de colonias se debe realizar en el agar sangre. Las dems placas deben ser
estriadas de tal forma que se obtengan colonias aisladas.
 MTODOS DE INOCULACIN PARA EL RECUENTO DE COLONIAS
MTODO DEL ASA CALIBRADA
Para el aislamiento de colonias usar Agar Macconkey siguiendo el procedimiento anterior.
INCUBACION
Incubarse 16 a 18 horas a 35 - 37 C, ambiente aerbico.
Incube 48 horas urocultivo negativos con sedimento urinario alterado y sembrar en Agar Sangre con estra.
Realizar cultivos anaerbicos en aspiracin suprapbica, en una fstula vesiculoentrica y cuando se
observen diferentes morfotipos bacterianos en el examen directo pero no crecen en cultivo aerbico.
Incubar el A. Sangre en 5% de CO2 para mejorar el desarrollo de los organismos gram (+) y bacterias
dependientes de CO2.
LECTURA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Lectura final es a las 24 hrs.
En los siguientes casos se debe incubar el cultivo hasta por 48 horas:
La muestra ha sido obtenida por una tcnica invasiva, como Cateterizacin Pequeas o pocas colonias
que hacen una lectura discernible.
Paciente inmunosuprimidos incluye pacientes que han sido trasplantados.
Se requiere cultivo para hongos o levaduras ( ejm: cultivos de UCI neonata!).
Comunicarse con el mdico tratante ya que existen otras causas de sedimento urinario alterado que no
corresponden a ITU o para saber si el paciente est recibiendo antibiticos.
UROCULTIVO POSITIVO
Los cultivos (+), examinar los medios de cultivo para la cuantificacin y tipo morfolgico de los organismos
presentes.
0.001ml 1colonia=1000UFC/ml
0.01ml 1colonia=100UFC/ml
Cuando las colonias son demasiado numerosos para contar.
El mximo recuento usando el asa de 1ul es >105 UFC/ ml.
El mximo recuento usando el asa de 10ul es >104 UFC/ml.

ESTUDIO POSTERIOR DE LOS CULTIVOS POSITIVOS:

Determine el recuento de colonias de cada morfotipo en el cultivo por separado examinando el agar sangre.
Streptococcus agalactiae debe ser reportado de mujeres en edad frtil y de diabticos conocidos,
independientemente del recuento.
Debido a que E. coli representa el 80% de los patgenos en cultivos de orina, utilic mtodos de
identificacin rpida para identificar esta especie.
Mantenga las placas con cultivo positivo a temperatura ambiente hasta 48 por si el mdico solicitara algn
estudio adicional.
Mantenga las muestras de orina en refrigeracin por lo menos 24 horas para resolver cualquier problema
con la muestra o resultados del cultivo.
No informar recuento en levaduras
 FASE POST-ANALITICA

REPORTE DE RESULTADO
a) Reporte de la Tincin Gram: resultados de bacterias y clulas.
b) Cultivos Negativos,
Reportar: de acuerdo al asa calibrada utilizada.
Negativo dil 1/100 UFC/ml
Negativo dil 1/1000 UFC/ml. por 24 o 48 horas.

c) Cultivos positivos, reportar: Si solamente se observa microbiota urogenital o de la piel, reportar

como cultivo negativo y el recuento ser de "10,000 UFC/ml de microbiota urogenital normal.
Los cultivos mixtos son reportados con el recuento en UFC/ml, seguido por "mltiple morfotipos
bacterianos presente, posible contaminacin; se sugiere nueva muestra.
Reportar el recuento de colonias de cada patgeno por separado.
Cuando se observa inhibicin por antimicrobianos, reportar: Se detect inhibidor antimicrobiano con su
recuento respectivo.
INTERPRETACION
El criterio de >_ 105 UFC/ml para significancia puede ser aplicado a la mayora de las muestras enviados
para cultivo. Sin embargo, lo siguiente ser cierto.

Un cultivo mixto en un paciente ambulatorio no complicado probablemente indica contaminacin.

Recuentos menores (<104/ml) de bacterias comnmente encontrados sobre la piel y genital interno y
externo son considerados ser contaminantes, pero en circunstancias especiales, un recuento de
Enterobacteriaceae de 102 UFC/ml o ms, pueden ser considerado significativo.

Recuento de colonias <105 UFC/ml en muestras emitidas con presencia de disuria y sntomas de ITU
puede ser significativo.
 Tener en cuenta los siguientes criterios para la interpretacin de resultados:

a) En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de bacterias en orina es la presencia de ms de 105
UFC / ml de un solo germen, se confirma en 92% de casos si el grmen aislado es gram negativo y en 70%,
si es gram positivo.
Recuentos entre 105 y 103 UFC/ml, si el paciente es sintomtico o si el grmen es S. saprophyticus o
Enterococcus spp. Hacen diagnstico de ITU.

b) Los recuentos intermedios (103 104 UFC / ml) indican infeccin si el procedimiento de recoleccin de orina
fue realizado correctamente.
Grmenes normalmente encontrados en la piel o genitales externos e internos. Pero en ciertas circunstancias
recuentos de 102 UCF/ml o ms especialmente por Salmonella o Shigella pueden ser considerados
significativos.

c) Generalmente, el aislamiento de tres o ms especies bacterianas indican que la muestra se ha

contaminado por recoleccin inadecuada o demora en la siembra.

d) En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 105 UFC / ml pueden tener significado,
as tambin se pueden encontrar bacteriurias polimicrobianas hasta en casi 15% de enfermos.
e) En pacientes sin infecciones del tracto urinario, el recuento es nulo o se reduce a pocas colonias.

f) En muestras obtenidas por puncin suprapbica, el desarrollo de una sola colonia en el medio de cultivo
indica infeccin del tracto urinario.

g) Si en el urocultivo desarrolla flora polimicrobianas, sospechar contaminacin y repetir el estudio. Sin

embargo hay situaciones en que la flora puede ser polimicrobiana: portador de sonda vesical, vejiga
neurgena, fstula vsico-intestinal o vsico-vaginal
h) Cuando el urocultivo es positivo y el paciente est asintomtico, es necesario repetir el estudio.
.

NOTA1: Se usa asas de siembra 0.001 mL para todas las muestras de orina a
excepcin de aquellas procedentes de aspirados suprapbicos, de infantes, de nios y de pacientes con
tratamiento antimicrobiano, las cuales se inocularn con asas de 0.01 mL debido a que en dichos pacientes
pueden haber infecciones del tracto urinario asociados a recuentos menores de 10105 UFC/ ml.

NOTA 2:De no contar con asa calibrada, utilizar tips estriles y micropipeta de 1ul o 10uL.
DETERMINACIN DE SUSTANCIAS ANTIBACTERIANAS RESIDUALES
EN ORINA
Determinar la presencia de sustancias antibacterianas residuales en orina.

Materiales
Pinzas
Discos de papel de filtro estriles de Papel filtro.
Placa de Agar Muelle Hinton 100 x 15 mm.
Tubo con solucin salina estril x 2 ml.
Cepa de Bacillus subtilis.

Procedimiento
suspensin de B. subtilis con solucin salina similar al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland.
Sembrar la placa de A. Mueller Hinton con la suspensin de bacterias de manera similar a un
antibiograma.
Dejar secar a temperatura ambiente aproximadamente 15 min.
Tomar con la pinza un disco de papel filtro y colocarlo en la placa sembrada.
segn una plantilla numerada o colocando el nmero en la parte posterior de la placa.
Colocar 10 L de orina con una asa calibrada o una micropipeta
La placa ser incubada a 35C por 18 horas en aerobiosis.
Interpretacin
Se buscar la presencia de un halo de inhibicin alrededor del disco con la orina.
Cualquier dimetro de halo se considerar como prueba positiva. La ausencia de halo se considera como
prueba negativa.

Report de resultados
El resultado se informa como "Actividad antimicrobiana: Positiva o Negativa
Comentario
El medio de cultivo debe estar a temperatura ambiente y la superficie debe estar seca.
Mantener la cepa de Bacillus subtilis en un tubo o placa de agar Mueller Hinton, todas la semanas hacer una
resiembra para la prueba.
 PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DEL ANTIBIOGRAMA
VALORES CRTICOS DEL ANTIBIOGRAMA
Los valores de las concentraciones y de los dimetros crticos que delimitan las categoras (S, I, R), son la
integracin de un conjunto de elementos: la distribucin de las CIM para diversas poblaciones de cepas
sensibles y resistentes, las concentraciones sricas y tisulares de los antibiticos.

PROCEDIMIENTO DE CATEGORIZACIN
Para los principales antibiticos, los valores crticos de las concentraciones bajas (c) y altas (C) y de sus
dimetros correspondientes (d, D), permiten la categorizacin segn los siguientes criterios (Tabla1):
La lectura interpretativa del antibiograma, fundada en el conocimiento de los antibiofenotipos de sensibilidad y
resistencia permite recategorizar un resultado inicialmente S en I o R debido al riesgo de fracaso teraputico.
Esta lectura interpretativa requiere la identificacin correcta de la bacteria y una correcta realizacin del
antibiograma.

MATERIALES Y EQUIPOS
los equipos utilizados deben estar en condiciones ptimas. El correcto funcionamiento de los instrumentos y
equipos nos asegura la garanta de la calidad, as como el mantenimiento de buenas prcticas de seguridad
tiene una importante influencia sobre el trabajo y productividad global del laboratorio.

Recomendaciones Generales
Cada instrumento tiene sus propias caractersticas y por lo tanto indicaciones especificas de mantenimiento y
su respectivo control de calidad; sin embargo, hay recomendaciones generales que son aplicables a todo
equipo de laboratorio como:
a. Precauciones elctricas:
. Los elctrico debe estar conectado a tierra y no sobrecargar los circuitos.
. Los equipos de funcionamiento como estufas, refrigeradoras, congeladores etc deben conectarse a un
generador electrgeno de emergencia.
b. Limpieza de las superficies externas:
Utilizar toallas con suave embebidas como alcohol de 70%
Usa hipoclorito de sodio.
c. Actividades dependientes de la Temperatura:
. Incubadoras ( 1C), baos de agua ( 1C), refrigeradoras (4- 8C), congeladores estndar ( 5C),
Autoclave 121C/ 15 min ( 1C), cabinas de bioseguridad (velocidad del flujo de aire debe sus lmites
de tolerancia de 45 55 pies/min). el flujo de aire, luz UV y el filtro deben ser verificado cada 6 meses.
Equipos Materiales MEDIOS DE CULTIVO Y
REACTIVOS
Potenciometro pH metros Vernier o Regla

Incubadoras Termmetros Agar Mueller Hinton

Refrigeradores Pinza punta plana Caldo Mueller Hinton
Autoclave Placas Petri Agar Mueller Hinton con 5% de
sangre de carnero
Cabinas de bioseguridad Erlenmeyer Haemophilus test medium (HTM)
Bao mara Hisopos de Discos de sensibilidad antibitica
Algodn
Espectrofotmetro o Tubos con Tapa Cloruro de Bario (BaCl2)
Fotocolormetro Rosca
Vortex (digitador para tubos) Pipetas cido Sulfrico (H2SO4)
PREPARACIN DEL AGAR MUELLER HINTON
Autoclavar y dejar enfriar en bao de agua hasta que alcance los 45C - 50C.
Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar .
El valor del mismo debe encontrarse entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente.
Repartir el medio en placas Petri (60 ml 70 ml o 25 ml 30 ml, para placas de 150 mm o 100 mm de
dimetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de 4 mm.
Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando una o dos placas de
cada lote a 30C 35C durante 24 horas o ms. Estas placas utilizadas deben ser, luego,
descartadas.
PREPARACIN DEL ESTNDAR (0,5 MC. FARLAND) PARA EL INCULO

Agregar 0,5 ml de una solucin de y 99,5 mL de una solucin de en constante

movimiento para mantener la suspensin.

Verificar la densidad correcta del estndar usando un fotocolormetro espectrofotmetro, cuya

absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el estndar 0,5 de Mc. Farland.

Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapn de jebe, similares a los que se usarn
para preparar el inculo.

Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a temperatura ambiente y anotar la
fecha de preparacin.

Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estndar de preferencia, en un agitador mecnico

Verificar mensualmente la densidad de los estndares de sulfato de bario, y reemplazarlo cuando

sea necesario.
SELECCIN DE LOS DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA

Los antibiticos han sido realizado teniendo en cuenta los siguientes criterios:
a. Eficacia clnica documentada.
b. Representatividad de una familia de antibiticos.
c. Disponibilidad de criterios tcnicos fiables para la determinacin in vitro de su eficacia clnica.
d. Estabilidad de la molcula en los discos para antibiograma.
e. Presencia en el mercado nacional.
f. Importancia para la vigilancia de la resistencia bacteriana.
PREPARACIN DEL INCULO

Puede realizarse de dos formas:

Mtodo de desarrollo previo

a. Seleccionar cuatro a cinco colonias bien aisladas, del mismo tipo morfolgico, de un cultivo en placa.

b. Tocar la superficie de cada colonia con una asa de siembra y transferirlo a un tubo que contiene de 4
a 5 mL de caldo apropiado (Ej. Caldo Tripticasa soya).

c. Incubar el caldo a una temperatura entre 35C a 37C, hasta que alcance o exceda la turbidez del
estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo general de 2 a 6 horas).

d. Ajustar la turbidez del inculo con solucin salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escala de
Mc. Farland, por comparacin visual con el estndar. Para realizar este paso correctamente usar una
luz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con lneas negras como contraste.

e. La suspensin preparada contendr aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL para E. coli ATCC 25922.
 Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas
a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 - 24 h, seleccionar colonias aisladas y
preparar una suspensin directa en solucin salina caldo.
b. La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland.

. Inoculacin de las Placas

Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inculo, sumergir un hisopo estril en
la suspensin, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo
por encima del nivel del lquido para remover el exceso de inculo.

Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones
para asegurar una distribucin uniforme del inculo. Antes de colocar los discos dejar
secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad
superficial sea absorbido.
APLICACIN DE LOS DISCOS
Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza
estril o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto
completo con la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente, de modo que estn a una distancia mnima de 25 mm uno del
otro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) debe
ser de 6 mm). No deben colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6 en una
placa de 100 mm de dimetro interno, para evitar la superposicin de las zonas de inhibicin. Un
disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que
algunos antibiticos se difunden rpidamente.
INCUBACIN

Incubar lar placas en posicin invertida a 35C dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicacin de los
discos.
Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmsfera del 5% de CO2.
Despus del tiempo recomendado de incubacin examinar cada placa y medir los dimetros de los halos
de inhibicin alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp y Enterococcus spp el tiempo
de incubacin debe prolongarse por 24 horas para una mejor deteccin de la resistencia a Oxacilina y
Vancomicina, respectivamente.
LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Medir los dimetros de las zonas de inhibicin usando una regla o calibrador.
Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa Petri con una luz reflejada localizada a unos
cuantos centmetros sobre un fondo negro.
En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del
agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemlisis sino la de inhibicin del
crecimiento.

Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida ,manteniendo la placa arriba de la luz
para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/Meticilina o Vancomicina
dentro de los halos aparentes de inhibicin. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibicin es
indicativo de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina.
 ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae
MEDIO DE CULTIVO: Agar Mueller Hinton
INOCULO: Mtodo de crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al
estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA

Grupo I Grupo II
Ampicilina Cefoxitina
Cefalotina Aztreonam Ampicilina
Ampicilina / Sulbactam o Ceftazidima Cloramfenicol
Amoxicilina / cido Clavulnico.
Cotrimoxazol
Cefuroxima Cefixima (Trimetoprim/Sulfametoxazol)
Cefotaxima o Ceftriaxona Cefoperazona/Sulbactam
Ciprofloxacina
Gentamicina Cefepime o Cefpirome
Amikacina Imipenem o Meropenem Cefotaxima
cido Nalidxico Cloramfenicol
Norfloxacina Ofloxacina
Ciprofloxacina
Cotrimoxazol
(Trimetoprim/Sulfametoxazol)
Nitrofurantona
Disco utilizado para infecciones de las vas urinarias
 Resistencias Naturales
Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos.

Klebsiella spp R Aminopenicilinas

Citrobacter freundii, Enterobacter R Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,

cloacae y Enterobacter aerogenes Cefalosporinas 1era generacin y Cefuroxima.

Serratia marcescens R Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,

Cefalosporinas de primera generacin y Cefoxitina.

Proteus mirabilis R Nitrofurantona.

Proteus vulgaris R Aminopenicilinas, Cefalosporinas 1era generacin,
Cefuroxima y Nitrofurantona.
Morganella morganii R Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,
Cefalosporinas 1era generacin, Cefuroxima y
Nitrofurantona.
Providentia stuartii R Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,
Cefalosporinas 1era generacin, Gentamicina (bajo nivel) y
Nitrofurantona.
 INCUBACIN
35C
LECTURA
15-18 h
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS
Antibiticos y dimetros crticos
 DETECCIN DE LAS ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE
ESPECTRO EXTENDIDO
Algunas cepas productoras de estas enzimas pueden presentar halos de inhibicin lo suficientemente
grandes como para ser clasificadas errneamente como sensibles a las Cefalosporinas de tercera
generacin y a Aztreonam. Con el objeto de superar esta dificultad, la tabla 7 seala los dimetros para
Ceftazidima, Cefotaxima, Ceftriaxona y Aztreonam que sern utilizados como test de tamizaje y que permiten
sospechar la presencia de estas enzimas: Si la cepa estudiada presenta halos de inhibicin, para al menos
uno de estos antibiticos, iguales o inferiores a los dimetros referidos en tabla 7 deber realizarse un test
confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido.