HPLC

OPTIMIZACIN DE LA SEPARACIN
Adilenne Vite Diaz

 Objetivo de la separacin de compuestos en una

mezcla
Resolucin adecuada
Pureza
Menor tiempo

Eleccin del sistema

Separacin a realizar (analito)
Fase estacionaria
Fase mvil
Detectores.

Tiempo o volumen muerto

Numero de platos tericos

Hmin

F : flujo de la fase mvil

(mlmin-1)
dc= dimetro de la columna
(cm)

dp=dimetro de la particula

 Ya seleccionada la fase estacionaria la

optimizacin se basa:
Variacin de Temperatura

Variacin de la fase mvil

Efecto de la fase mvil.
HPLC fase reversa.

Mecanismo de reparto en HPLC de Fase reversa

Fase estacionaria :
No polar
Compuesta de Slice tratada con metil clorosilano de cadena alqulica de
longitud variable.

Fase mvil : moderadamente acuosa y polar.

 Los compuestos polares eluyen

primero
Buena separacin: equilibrio de
las fuerzas intermoleculares entre
el soluto con la fase mvil y fase
estacionaria.
Polaridad relativa.
El agua es la mas polar.

La retencin se puede incrementar aadiendo ms

agua a la fase mvil (Hidrofilica)
Se aumenta la afinidad del analito hidrofbico por la fase
estacionaria (Hidrofbica) .

La retencin puede disminuir aadiendo mayor

cantidad de disolvente orgnico a la fase mvil

Fase reversa: principio de fuerzas hidrofbicas

 La interaccin del
analito con la fase
estacionaria es
proporcional a la
superficie de contacto
alrededor del
segmento apolar del
analito en asociacin
con el ligando en la
fase mvil acuosa

 Eleccin de la columna para un mecanismo de

reparto.

La polaridad de la fase estacionaria ha de ser

bastante similar a la de los analito

Elucin: Fase mvil de polaridad distinta.

Polaridad similar: soluto y fase mvil

Seleccin de la fase mvil en

cromatografa de reparto
Mtodos para mejorar la resolucin de una columna
Variacin del numero de platos tericos (N)
Factor de capacidad (k)
Mas fcil de manipular
Depende de la composicin de la fase mvil.

Selectividad ()

 Variacin de la Selectividad : modificacin de la

composicin de Fase mvil.
Dos mtodos diferentes

Elucin isocrtica
Constante
Un solo disolvente o mezcla de disolventes.

Elucin en gradiente
Variando de forma continua la composicin de los disolventes
Fuerza se vaya incrementando durante el tiempo de anlisis
Fase mvil de fuerza dbil se va incrementando.

 Dos tipos de gradientes:

Lineales . La velocidad de
cambio del disolvente fuerte es
lineal en el tiempo. (5)

Exponenciales:
Convexos (1-4)
Rpidas
Picos superpuestos al final del
cromatograma.

Concavos (6-9)
Lentas
Picos superpuestos al inicio del
cromatograma.

Efecto de la fuerza del disolvente

sobre k

Disolventes fuertes: Interaccionan fuertemente con el soluto

Para descubrir cuantitativamente la polaridad de los disolventes se

han desarrollado varios ndices.

ndice de polaridad, desarrollado por Snyder (P)

Parmetro de solubilidad de Hildebrand ()

Y la fuerza elutrpica como disolvente ()

ndice de polaridad (P)

Coeficientes de reparto corregidos (Kg)

Interacciones dispersivas y efectos de la masa molecular

tres interacciones moleculares aditivas

Donacin de protones (d)

Aceptacin de protones (e)

Dipolos fuertes (n)

Mide la atraccin intermolecular de un soluto con un disolvente

 Se basa en las medida de solubilidad para la sustancia

en cuestin
Dioxano (aceptor de protones de dipolo dbil)
Nitrometano (un aceptor de protones de dipolo intenso)
Etanol (donador de protones de dipolo intenso

 Parmetro de solubilidad de Hildebrand ()

Se define para un disolvente puro
Predecir la solubilidad de unos lquidos en otros
Es una medida de las fuerzas entre molculas, o de la presin
interna de una sustancia
E vap, es la energa molar de evaporacin, en (Jcm-3) y V, el
volumen molal del lquido

 Fuerza elutrpica o fuerza como disolvente

()
Define la energa de adsorcin de cada
disolvente por unidad de superficie de slice
respecto al valor de o del pentano
Cuanto mayor es la polaridad del disolvente,
mayor es su valor de

 Disolventes miscibles : amplia gama de valores de

Depende del sistema cromatgrafico y el valor de

no varia linealmente con la composicin de una
mezcla.

Cromatografa de Reparto en F. Normal, la fuerza de arrastre

de la fase mvil el mayor cuanto mayor sea se valor de
Cromatografa de Reparto en fase Reversa, la fuerza de
arrastre de la fase mvil es menor cuanto mayor sea su valor
de

La forma mas fcil de mejorar la resolucin es manipilar el valor de k

Un cambio de dos unidades en el valor de P origina una variacin de 10

veces en k

La elucin en gradiente disminuye la retencin de los ltimos solutos

haciendo que eluyan antes y sean ms estrechos.

Incrementa la altura del pico

 a) La utilizacin de gradiente est justificada cuando

se trata de mezclas de componentes con un amplio
rango de polaridad.
b) Es conveniente hacer primero un gradiente amplio
(entre el 5% y el 100% de disolvente fuerte, en 40-60
minutos), para decidir si se utiliza una elucin
isocrtica o en gradiente.

donde, tR, es la diferencia en tR entre el primero y el

ltimo pico del cromatograma y tG, el tiempo de
gradiente: el tiempo en el que cambia la composicin
de la fase mvil.