CROMATOGRAFA

Fase estacionaria: slido o lquido fijado a un slido

Fase mvil: fludo (lquido o gas) que arrastra la muestra a travs de la
fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de

manera diferente con las dos fases establecindose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partculas adsorbidas y desorbidas

=
coeficiente de reparto

[molculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]

FASE MVIL

FASE
ESTACIONARIA

Clasificaciones de cromatografa
1. Segn como se encuentre la fase estacionaria
a. columna

b. batch

c. plana cromatografa en papel y en capa fina

2. Segn el tipo de fase estacionaria y fase mvil

Fase estacionaria

Fase mvil

Slida

Lquida o gaseosa

Lquido adsorbido

Lquida o gaseosa

3. Segn el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fludo a presin (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografa a baja presin
Tiene mejor resolucin, tiempos menores, mejor reproducibilidad
El material empacado en las columnas est formado por pequeas
partculas de tamao muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presin

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable

o vidrio grueso

FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y

equipamiento especialmente diseado para
separar o purificar protenas
Las columnas de FPLC soportan menos
presin que las de HPLC

4. Segn la finalidad del experimento

Separacin y purificacin

Separacin, cuantificacin y
caracterizacin

Preparativa

Analtica

4. Segn la interaccin entre la fase mvil y el soluto

a. Cromatografa de intercambio inico

carga-carga

b. Cromatografa de interaccin hidrofbica

c. Cromatografa de afinidad

efecto hidrofbico

variada pero especfica

d. Cromatografa de afinidad por metales

inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografa de fase normal y reversa

enlaces coordinacin

dipolo-dipolo

Cromatografa de intercambio inico

La separacin se basa en diferencias de carga a un pH dado
Las interacciones son electrostticas
Dos tipos

DEAE
Q (DEPEA)

Intercambio aninico: matriz cargada

positivamente (DEAE, TEA, QAE)
Intercambio catinico: matriz cargada
negativamente (CarboxiMetilos (CM),
Sulfonatos (S), fosfatos)

Q (TMEA)
CM
S

Elucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza inica o

ambos

Cromatografa de intercambio inico

La carga neta de la protena depende de su p.Isoelctrico y el pH
Interaccin con:
Intercambiador
catinico

Intercambiador
aninico

Elucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza inica o

ambos

Cromatografa de intercambio inico

Amonio Quaternario

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de afinidad
Se basa en una interaccin biolgica especfica:
Enzima-sustrato
Anticuerpo-antgeno
Enzima-coenzima
Protena-ligando especfico

La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est unido a la

columna) en solucin o mediante cambios en el buffer que sean
capaces de debilitar la interaccin

Cromatografa de afinidad
Interaccin Biolgica especfica:
Inmovilizado en Columna

Protena

Glutatin

Recombinante de fusin con GST

Protena A (o G)

Anticuerpo - IgG

Streptavidina

Conjugada con biotina

Quelante con Ni2+

Recombinante de fusin poliHistidina

La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est unido a la

columna GSH / Imidazol) en solucin o mediante cambios en el
buffer que sean capaces de debilitar la interaccin (bajar el pH, etc.)

IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formacin de enlaces de coordinacin entre iones
metlicos inmovilizados y grupos bsicos en protenas (histidinas)
Principalmente a los iones divalentes de metales de transicin
como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elucin se lleva a cabo adicionando quelantes ms fuertes como el

imidazol a distintas concentraciones (hasta 500 mM) o cambios en el pH

Es muy utilizada para la purificacin de protenas recombinantes

Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo N t o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+

Cromatografa de interaccin hidrofbica

El soporte est sustitudo con cadenas
alifticas de 2 a 10 carbonos (eter, c4-c8) u
otros grupos hidrofbicos (Fenilos)
La interaccin es de tipo hidrofbica
(guiada por entropia)
La fase mvil debe tener una alta concentracin de sales
((NH4)2SO3 2 4 M)

Salting out
Para la elucin se disminuye la concentracin de sales en la fase mvil

Cromatografa de interaccin hidrofbica

Cromatografa de interaccin hidrofbica

Cromatografa de fase reversa

Est muy relacionada con la cromatografa de interaccin hidrofbica
pero son diferentes
El soporte est sustitudo por alifticas pero ms largas (8 -18 carbonos/
C8-C18) y la densidad de sustituyentes es mayor

La unin es ms fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no

polares para la elucin
Desnaturaliza protenas Se usa mas para pptidos y algunas
protenas particularmente hidrofbicas
Se utiliza en HPLC

Cromatografa de fase reversa

Gel filtracin (cromatografa de exclusin molecular / SEC)

No es una cromatografa estrictamente porque no ocurre adsorcin
La separacin se da por tamao radio hidrodinmico

El gel debe ser inerte, de tamao de poro definido y sin carga

Las protenas mas pequeas pueden entrar por difusin simple en las
partculas en la fase estacionaria, por lo que son retenidas ms tiempo y
salen ms tarde en una cromatografa.

Aplicaciones:
Cambios de buffer / desalado PD-10 (gravedad) / HiTrap (FPLC)

Aplicaciones:
Determinacin del peso molecular

Aplicaciones:
Purificacin de protenas

Concluyendo.
La pregunta ms importante

En qu son distintas las sustancias que deseo separar?