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Validazione di un

metodo di analisi

Validazione
Validazione di un metodo analitico:
Conferma attraverso lesame e lapporto di
evidenza oggettiva che i requisiti particolari
per lutilizzazione prevista siano soddisfatti
(UNI EN ISO 9000:2000)

Quando
validare
un
metodo?
Quando un metodo
non normato
sviluppato e/o progettato dal laboratorio
normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di
applicazione prefissato
le pi comiuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono
le seguenti:
un nuovo metodo sviluppato per scopi particolari;
un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o esteso
ad un nuovo problema analitico;
il controllo di qualit evidenzia variazioni temporali dei parametri di
qualit;
un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un
diverso analista, con diversa strumentazione;
necessario dimostrare lequivalenza del metodo in esame con un
metodo standard.

Validazione
Il laboratorio che utilizza un metodo
deve avere la documentazione che
dimostri lappropriata validazione del
metodo stesso.
responsabilit dellutilizzatore
assicurare che la validazione
documentata sia sufficientemente
completa

Validazione
Non ci sono linee guida ufficiali per la
sequenza degli esperimenti necessari
per la validazione
La sequenza ottimale pu dipendere
dal metodo stesso
E` sempre necessaria la stima
dellincertezza di misura

Parametri che caratterizzano un


metodo analitico
Campo di misura
Specificit-selettivit analitica
limite di rivelabilit e di quantificazione
range dinamico e lineare
accuratezza intesa come esattezza pi
precisione (questultima a sua volta distinta
in ripetibilit, precisione intermedia e
riproducibilit)
incertezza di misurazione
robustezza.

Campo di misura (validit)


Intervallo tra il pi alto e il pi basso livello
dellanalita determinabili con precisione ed
accuratezza applicando il metodo stesso
Il campo di misura (validit) espresso
nella stessa unit di misura dellanalita
Dipende dallo scopo del metodo

Specificit-Selettivit analitica
Specificit: Si riferisce ad un metodo che
produce una singola risposta
Selettivit: si riferisce ad un metodo che
produce pi risposte (metodo separativo)
ABILIT DI MISURARE ACCURATAMENTE
LANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI

Limite di rilevabilit

la pi bassa concentrazione dellanalita


che pu essere rilevata, ma non
necessariamente determinata
quantitativamente, nelle condizioni
sperimentali del metodo
LdR=3*Sb/S

Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)


S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Limite di quantizzazione
La Pi bassa concentrazione analitica che
pu essere determinata quantitativamente
con accettabile precisione ed esattezza
nelle condizioni sperimentali del metodo
LdQ = 10*Sb/S

Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)


S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Linearit
La linearit di un metodo analitico la sua
abilit di dare risultati che sono direttamente
proporzionali alla concentrazione degli
analiti nei campioni allinterno di un
determinato campo di validit
la proporzionalit pu essere raggiunta
anche attraverso trasformazioni
matematiche ben definite

Linearit
Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di
correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile,
con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di
taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti
soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa
specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono
generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il
metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99.
Una non-linearit significativa dovrebbe essere corretta
mediante l'utilizzo d funzioni di taratura non lineari o eliminata
restringendo lintervallo di concentrazioni in cui si opera.

Linearit
Si deve effettuare almeno da 3 a 6
repliche di 4 o pi concentrazioni
Nella validazione del metodo devono
essere riportati il coefficiente di
correlazione, la pendenza, lintercetta e
i residui, oltre ad un grafico dei dati
sperimentali e della curva calcolata

Esattezza
Grado di concordanza tra il valore
medio ottenuto a partire da un grande
insieme d risultati di prova, e un valore
d riferimento accettato

Per la valutazione dellesattezza:


Confronto con un metodo analitico di ordine
metrologico superiore
Analisi di idonei materiali di riferimento
certificati a diversi livelli di concentrazione
Confronto con i valori attesi in studi
collaborativi (circuiti interlaboratorio)
Analisi di idonei campioni costruiti
aggiungendo alla matrice quantit certificate di
analita (Spike) a diversi livelli di
concentrazione

Ripetibilit
concordanza tra risultati di prova indipendenti
ottenut con lo stesso metodo su materiali
dentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso
operatore, usando la stessa apparecchiatura
e in intervalli di tempo brevi (stessa serie
analitica)

Per valutare la ripetibilit si possono usare:


Campioni reali
Materiali di riferimento certificati nella stessa
matrice
Materiali di riferimento in matrice ottenuti per
aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della
sostanza pura

Precisione intermedia
Concordanza tra risultati di prova indipendenti
ottenuti con lo stesso metodo su material
identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso
operatore, usando la stessa apparecchiatura e in
intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche
con possibilit di cambiamento del lotto dei
reattivi e dei materiali di consumo).

Per valutare la Precisione intermedia si


possono usare:
Campioni reali
Materiali di riferimento certificati nella stessa
matrice
Materiali di riferimento in matrice ottenuti per
aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della
sostanza pura

Riproducibilit
concordanza tra risultati di prova
indipendenti ottenuti con lo stesso metodo
su materiali identici, in laboratori diversi, da
operatori diversi, usando apparecchiature
diverse e in intervalli di tempo diversi

Incertezza di misura

stima legata ad un risultato di prova che


caratterizza l'escursione dei valori entro cui si
suppone che cada il valore vero del
misurando Ha le dimensioni di uno scarto
tipo e si indica con U"

valutare lincertezza pu essere


riassunto nei seguenti punti:
specificazione del misurando (eseguita nel
metodo di prova)
definizione della relazione che lo lega alle
grandezze misurate nel metodo di prova (ad
esempio modello matematico per la misura
della concentrazione specificato nel metodo di
prova)

identificazione dei fattori che possono


contribuire all'Incertezza di misura per ogni
stadio del processo eseguito in laboratorio
(indicati nel metodo di prova)
raccolta dei dati relativi alle prestazioni del
metodo (studi collaborativi, studi di
validazione in laboratorio, circuiti
inetrlaboratorio)

quantificazione dei vari contributi


all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni
del metodo, esprimendole come varianze o
scarti tipo (incertezze tipo):
u(xi)
combinazione delle incertezze tipo per
ottenere l'incertezza composta:
uc(y)

trasformazione dell'incertezza composta in


incertezza estesa
U(y) = K uc (y)
moltiplicando per il fattore di copertura (K)
In generale K=2.

Robustezza
Insensibilit a piccole variazioni dei
parametri sperimentali
Variazioni deliberate
% solventi organici
pH
temperatura
Flusso