INHIBICION DE Vibrio parahaemolyticus

PRESENTE EN Litopenaeus Vanamei

MEDIANTE LA APLICACIN DE
BACTERINA Y LEVOFLOXACINA.

Grupo 1: Iveth Fuentes C.

Hernn Herrera G.
Vernica Paredes P.
Fabin Rosales F.

Hipotesis

El antibitico levofloxacina es ms
eficiente que la bacterina para la
inhibicin de Vibrio parahaemolyticus
presente en Penaeus vanamei

Objetivos

Determinar la concentracin mxima inhibitoria del

antibitico levofloxacina y/o bacterina para Vibrio
parahaemolyticus presente en camarn.

Realizar los anlisis patolgicos y histopatologcos para

determinar la presencia y efectos que causa la bacteria
Vibrio parahaemolyticus en el camarn.

Introduccion

MATERIALES Y METODOS

CLCULOS DE LAS
CONCENTRACIONES

E: preparacin de la solucin de trabajo 1000ug/ml, F:

dispensando la muestra de antibitico en el tubo de
eppendorf de la solucin de trabajo, para poder tener un
volumen final de 1500ul, G: colocando el antibitico en los
discos de sensibilidad a diferentes concentraciones, H:
colocando los discos de sensibilidad en el agar Mueller
Hinton.

Tabla 1: Procedimiento para realizar

la solucin de trabajo
Fuente: Trabajo grupal

MIC
Calculo de volmenes

PROCEDIMIENTO

A: suspender la bacteria en agua de peptona, B: medir la

solucin bacteriana en el densitmetro hasta tener 0.5 mc
farland que equivale a 10(8), C: colocar 100ul de la
suspensin en una placa y esparcirlo con un esparcidor de
clulas, D: tubos con antibiticos solucin de trabajo y
solucin stock
Tabla 2: Clculos de volmenes para el MIC

PROCEDIMIENTO

Cantidad
de Medio
Cantidad de
Antibitico
100ul de
Bacteria

SIEMBRA DE AGUA
DE PECERAS
Para observar si
nuestros
camarones
infectados
no
tenan el efecto
mariposa
,
sembramos
100ul de agua de
las
peceras
experimentales,
1088 y 1044 ..

A: colocando el agua de peptona hasta alcanzar el

volumen total del tuvo 1500ul, B: tubos de
eppendorf con un resultado presuntivo

Ejemplificacin de la siembra del agua

de las peceras.
Fuente: sitio web/ agares selectivos

BACTERINA
Solucin
bacteriana
Dispensar la solucin en
tubos de eppendorf
Colocar la solucin en mao
Mara (20 minutos)
Colocar solucin -20 (20
minutos)
Realizar esto por varias
veces
CONCENTRACIN
Sembrar 100ul de DE
bacteria
en
de agar TCBS
LAplacas
BACTERINA

A: centrifugamos la muestra de bacterina

junto con la del rgano blanco para que le
haga contrapeso colando en el lado contrario al
de la muestra, B: la centrifugamos a 7800rpm
y durante 10 minutos.

SIEMBRA DE RGANOS
FOCO
Se sembr
hepatopncreas
que es el
principal rgano
foco de la
vibriosis.

E: Trabajamos en una cmara de flujo laminar en BM para evitar

contaminacin al momento de poner la muestra en los frascos
mostradores para ponerla en el espectrofotmetro, F:
calibracin del espectrofotmetro utilizando una muestra en
blanco, G observando resultados de la calibracin para poder
colocar la muestra de bacterina, H: colocando la muestra de
bacteriana y muestra en blanco para saber el resultado de
concentracin de la bacterina.

RESULTADOS
MICROBIOLGICOS
ANTIBIOGRAMA

1B, 2B: en estas placas se colocaron concentraciones de

25,50 y 75ug/ul realizando una rplica de las mismas nos
podemos dar cuenta que el antibitico hasta en su mnima
concentracin (25ug/ml) es un bactericida de gran potencia
contra este tipo bacteria que se encontraba en una gran
concentracin, 1C, 2C: presentaron una gran inhibicin
utilizamos concentraciones muy altas para trabajar, 25,50,
75, 90 y 120ug/ul siendo todas muy letales.

Usamos la levofloxacina en
concentraciones altas para
observar
el
poder
bactericida que tenia frente
al Vibrio, por su poder de
amplio espectro. No se
encontr tratamiento de
este antibitico frente a
vibrio parahaemolyticus

50ug
/ml

MIC

SIEMBRA DE AGUA
DE PECERAS

35ug
/ml

30ug
/ml

Resultados del MIC luego de 24

horas

25ug
15ug
/ml
/ml
No
hubo
concentracin
mnima con el antibitico,
tubo una eficiencia con cada
una de las concentraciones
de trabajo.

Los
resultados obtenidos no
Resultados de siembra de agua de
peceras en
concentraciones de
fueron
satisfactorios
ya que
infeccin
en
el agua donde se
encontraban
nuestros
camarones
se
hubo
presencia de vibrios esto
ocasiono el llamado efecto
mariposa o contaminacin
horizontal, por esta razn
realizamos un recambio de
agua
para
evitar
este
efecto.

SIEMBRA DE
HEMOLINFA

Infecci
n 104

Infecci
n 108

Resultados de la siembra de hemolinfa

tomada directamente de las antenas del
camarn, despus de 18 horas de
infeccin.

BACTERINA

infeccin 10(4) y otro 10(8) el

camarn
de infeccin con alta
cantidad de bacteria solo fue una
experimentacin adicional al proyecto
ya que queramos observar el tiempo
y el avance rpido de la infeccin en
el animal, se limpiaron bien las
antenas y se procedi a cortarlas
tomando el camarn como una
especie de asa de siembra y
sembrando en forma de estras la
hemolinfa que sala de sus antenas.

Se pudo observar que el

camarn concentracin
de solucin bacteriana
tubo mayor presencia de
bacterias
en
su
hemolinfa.
Se realizo un antibiograma de
la bacteriana, para observar el
efecto de antibitico frente a
la bacteria pero fue poca la
inhibicin bacteriana, pero aun
al pasar 48 horas segua
mintindose
el
halo
de

Cantidad de inoculo
bacteriano en
bacterina.

Centrifugacin de la bacteria en
7800 rpm

Resultados del centrifugado de

bacteria y comparacin de peso

A: centrifugamos la muestra de bacterina junto con

la del rgano blanco para que le haga contrapeso
colando en el lado contrario al de la muestra, B: la
centrifugamos a 7800rpm y durante 10 minutos.
1. Pesar el tubo de ensayo en una balanza analtica,
2. Sacar el restante de agua despus de haberse
centrifugado y pesar el tubo con la muestra de
bacteria.
Resultados.
Mediante la diferencia de peso pudimos observar
que la muestra final tena 32mg/ml de bacteria.
La bacterina tena una concentracin de 32mg/ml o
es lo mismo decir 0.032ug/ml

SIEMBRA DE
Podemos observar
RGANOS
la gran presencia
de bacterias en el
rgano foco de la
infeccin
por
vibrios como es el
hepatopncreas,
no se puede sacar
un
numero
de
colonias
bacterianas ya que
a simple viste de
Camarones
observa
que
Hepatopncreas de
4
4 ..
infectados
10
camarn infectado
excede las 300
ufc /ml
UFC

Hepatopncreas de camarn
tra.1

Hepatopncreas con
tratamiento 2

Se observa el
crecimiento
bacteriano
en
menor gado de
intensidad que
el
animal
infectado
Camarones con
tratamiento 1
Sembramos
el
bacterina (2 da )de
hepatopncreas
dos
camarones,
notamos que en uno
de los animales se
puede
ver
una
notable disminucin
de la enfermedad
pero
el
segundo
animal
presenta
todava
la
enfermedad,
la
asimilacin
del
antibitico
Camaronesdepende
con
mucho
de
la
tratamiento 2
farmacocintica
levofloxacina
(2 dade
)

Materiales y Metodologia
5 sin tratamiento
15 control (+)
inoculados Vibrio
p. 104 ufc/ml (48
h.)

25 camarones

5 control (+)
inoculados Vibrio
p. 108 ufc/ml (24
h.)
5 control (-)

5 con antibitico
levofloxacina 25
g/ml (24 h.)
5 con bacterina 32
g/ml (24 h.)

Histopatologa

Se toma una muestra por cada grupo. Control +, antibitico y bacterina.

Son fijados con la solucin de Davidson's en el cefalotrax y abdomen hasta que

quede totalmente blanco, fueron mantenidos en frascos por 24 horas y enviados al
Centro de Servicios para la Acuicultura (CSA) para que realicen los cortes histolgicos

Figura 2. Fijacin de un camarn juvenil P. vannamei. La

solucin que se est inyectando al animal an vivo, es
Davidson - AFA. Ntese el cambio de color del
hepatopncreas que pas de amarillo (normal) a anaranjado,
por efecto del fijador luego de haber sido inyectado. Se
observa el uso indispensable de guantes para la manipulacin
de esta solucin fijadora.
Fuente: Jorge Cuellar, 2008

Hematologa

Se emplearon 4 camarones, 2 del grupo control y 2 infectados por inoculacin

con Vibrio parahemolyticus para los respectivos anlisis hematolgicos.
Se extrajo rpidamente 10 unidades de hemolinfa ubicada en zona de unin
entre el cefalotrax y el abdomen con una jeringa de insulina la cual
anteriormente contena 10 unidades de citrato de sodio al 10% que reacciona
como anticoagulante. Se tom una pequea cantidad de muestra de la jeringa
para realizar barrido por la tcnica de rutina con solucin de Giemsa y luego ser
observadas, otra pequea cantidad para realizar conteo en hemocitometro.

Microbiologia

Resultados: Patologa: Diagnostico Macroscpico

Vista

Paredes 2016

Paredes 2016

macroscpica de camarn peneido infectado y curado bajo el tratamiento con antibitico. Muestra los
siguientes signos externos:
Uropodos ligeramente rojos.
Antenas cortas lisas.
Pleopodos y periopodos normal.
Intestino lleno.
Hepatopncreas normal.
Exoesqueleto brillante.

Vista macroscpica de camarn peneido infectado y curado bajo el tratamiento con bacterina. Muestra los siguientes
signos externos:
Uropodos ligeramente rojos.
Antenas lisas.
Pleopodos y periopodos normal.
Intestino lleno.
Hepatopncreas normal.
Exoesqueleto normal.

Vista macroscpica de camarn peneido infectado y NO curado con ningn tratamiento. Muestra los siguientes signos

Paredes 2016

externos:
Uropodos rojos.
Antenas rugosas, cortas y ligeramente rojas.
Pleopodos y periopodos ligeramente rojos.
Intestino semilleno.
Hepatopncreas oscuro.
Exoesqueleto melanizado.

Vista macroscpica de camarn peneido NO infectado denominado control. Muestra los siguientes signos

Paredes 2016

externos:
Uropodos ligeramente rojos.
Antenas lisas.
Pleopodos y periopodos normal.
Intestino lleno.
Hepatopncreas normal.
Exoesqueleto normal

PATOLOGIA
BRANQUIAS

Antibiti
co

Enferm

EN

FRESCO

DE

Bacterin
a.

Muestra
control.

PATOLOGIA EN FRESCO DE
HEPATOPANCREAS

Antibitic
o

Enferm

Bacterin
a.

Muestra

PATOLOGIA
BRANQUIAS

Antibitic
o.

Enferm

EN

FRESCO

DE

Bacterin
a.

Muestra
control.

Resultados

Se pudo evidenciar a nivel macro y microscpico los diferentes signos

patolgicos, en los distintos rganos analizados, como el intestino y
hepatopncreas siendo este ltimo uno de los ms afectados a nivel
micro, y a nivel macro fue evidente en el exoesqueleto la melanizacion
sobre todo en el camarn infectado.
Existe presencia de gregarinas a nivel intestino y epicomenzales en las
branquias en todas las muestras y en diferentes grados, con excepcin de
aquellas que fue tratada con antibitico, que tuvo buena respuesta a
pesar hubo presencia de parsitos, cierto grado de suciedad,
melanizacion en las branquias, y detritus en el intestino.
Los signos patolgicos ms graves se evidenciaron en la muestra del
camarn infectado sin tratamiento,
aquellos con tratamiento de
bacterina presentaron una ligera mejora en cuento a branquias y
hepatopncreas, siendo similar diagnstico para las muestras control
donde su grado de signos clnicos son parecidos y marcando diferencia
con respecto al tratamiento con antibitico donde se evidencio mejor
respuesta y condiciones fisiolgicas de sus organos.

Histopatologia

Figura 4. ANTIBIOTICO. A. Hepatopncreas observado a 40x. B. HP

observado a 100x. Presenta Tbulos normales con lpidos.
Fuente: Paredes, 2016

Figura
1.
Hepatopncreas,
normales. Fuente: Heres, 2015

tbulos

Figura 3.. BACTERINA. A. Hepatopncreas observado a 40x. B. HP

observado a 100x. Presenta tbulos atrofiados, no posee lpidos.
Fuente: Paredes, 2016

Figura 2. Corte longitudinal de hepatopncreas.

Presenta perdida de la estructura normal de los
tbulos con ausencia de clulas epiteliales y
presencia de nodulaciones. Foto captada con
objeto de 10x.
Fuente: Fanny Panchana, 2011

Figura 5. Control (+). A. Hepatopncreas observado en 10x. B. HP observado en

40x. C. HP observado a 100x. Presenta necrosis, desprendimiento de clulas,
cepas bacterianas.
Fuente: Paredes, 2016

Hematologa

El conteo de clulas en el hemocitometro dio como resultado: del

Camarn enfermo, 10,856 cel/ml
Camarn infectado fue de 1,856 cel/ml, es decir que el camarn
infectado con Vibrio parahaemolyticus posee una anemia severa.

Figura 6. A. Control (-). B. Control (+).

Fuente: Fuentes, 2016

Figura 8. Control (-). Clulas

normales con presencia del ncleo.
100X.
Fuente: Fuentes, 2016

Figura 7. Control (+). Clulas hemocticos que

presentan pignosis. 100X
Fuente: Fuentes, 2016

Conclusiones

Se comprueba que la hiptesis es cierta, por los resultados

obtenidos el antibitico con una dosis de 25 g/ml, es ms
eficiente
al
combatir
contra
la
bacteria
Vibrio
parahaemolyticus presente en el camarn.