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Sintesi chimica del DN

Sintesi in fase solida di oligonucleot


Per la sintesi
vengono utilizzati
fosforamidi dei vari
nucleotidi. La
fosforamide
contiene un buon
gruppo uscente che
promuove la
reazione di
formazione di un
legame fosfoestere
(fosfito).
Il monomero
attivato aggiunto
contiene
dimetossitritile
(DMT) che protegge
il 5 OH e un gruppo
-cianoetilico di
protezione del
gruppo ossidrilico 3.
Dopo la sintesi i
legami fosfoestere

Sequenziamento

Sequenziamento con idrolisi chimica (Maxam and Gilber

(formic acid)

Uso di reagenti chimici che alterano una o al


massimo due basi.
La base alterata viene essere rimossa
(attraverso riscaldamento) e una seconda
reazione con piperidina porta alla rottura della
catena polinucleotidica nel sito abasico
I vari frammenti ottenuti dopo lidrolisi nelle
diverse condizioni sono separati su gel
Le molecole di DNA, sottoposte alIe differenti
reazioni chimiche e specifiche per le varie basi,
sono marcate ad una estremit. Questo
permette di visualizzare solo i frammenti che
iniziano con lestremit marcata e terminano
con il sito di taglio e la misura loro lunghezza
identifica la posizione della base che stata
alterata nella specifica reazione

Lettura della sequenza di DNA

Esempio dei frammenti, contenenti lestremit marcata,


ottenibili con lidrolisi chimica specifica per la guanina di una
molecola di DNA

Sequenziamento chain-terminator o metodo con


dideoxinucleotidi (Sanger, 1977)

Metodo enzimatico che richiede luso di una DNA-polimerasi e


specifici primer

La reazione condotta in presenza di paricolari


nucleotidi,ididesossinucleotidi, che se incorporati portano alla
prematura terminazione della sintesi del DNA perch privi del 3OH

Principio della
tecnica
3
5

T
primer

3
ddA
ddA
ddA
ddA

5
Nella reazione oltre al dATP
presente anche il ddATP (in
genere in rapporto 1:10).
Quando occasionalmente
viene incorporato il ddATP la
reazione di polimerizzazione
si interrompe e la lunghezza
del frammento mi fornisce la
posizione della base usata

Le molecole di DNA da
sequenziare vengono
sottoposte a quattro differenti
reazioni, in ognuna delle quali
presente un ddNTP.
Le reazioni di sintesi del DNA
vengono innescate da uno
stesso prime opportunamente
marcato per permettere la
migliore visualizzazione dei
frammenti prodotti.
I frammenti prodotti
durante la sintesi vengono
successivamente separati su
gel e, anche in questo caso, la
misura loro lunghezza
identifica la posizione della
base che stata utilizzata
come ddNTP nella reazione di

Lettura della sequenza di DNA

Sequenziamento automatico
Nelle quattro differenti reazioni di
polimerizzazione, oltre che essere
utilizzati differenti ddNTP, la sintesi del
DNA viene innescata dallo stesso
primer ma marcato con quattro
fluorofori differenti.
Questo permette di distingure i
frammenti che sono terminati dal
ddATP o da un altro ddNTP perch
hanno una fluorescenza differente.

I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e analizzati sullo stesso gel.
La separazione elettroforetica permetter di distinguere i vari frammenti in
base alle dimensioni e lo specifico colore di fluorescenza indicher la base
che si trovava in quella posizione.

Sequenziamento automatico

I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e separati in continua su gel o


elettroforesi capillare. Un rivelatore posto alla fine del ge,l o del capillare, e
analizza lintensit ed il colore del frammento che viaggia nel gel, permettendo
cosi di avere informazioni sul tipo di base presente al termine di quel frammento.
Il risultato una serie di picchi consecutivi, che rappresentano i vari frammenti
eluiti a dimensioni crescenti (ognuno pi lungo di una base) ed il colore identifica

La PCR

La Polymerase Chain Reaction o PCR

Replicazione in vitro di determinati


tratti di DNA, selezionati tramite
specifici primers

Come
funziona?
Miscela di reazione
3
5
3

5
3

3
3

d.NTPs

5Primers
5
5 5
3
3
5 3
5
3
5
5

Denaturazione
95C

5
3

3
5

5 3

Ripetizione del ciclo

Thermal Stable
DNA Polymerase

3
3

Taq

Estensione

5
3

Annealing
50-65C
5

Taq 5

5
5

3
3

Taq

5
5

Taq

Estensione
72C

La PCR (il primo ciclo)

La PCR (secondo ciclo)

17

Applicazioni della PCR


Amplificazione selettiva di specifiche regioni di DNA
(la sequenza di DNA amplificato delimitata dai
primers e la loro specificit determina la qualit
dellamplificazione
Indicazioni
sulla presenza di specifiche sequenze di
DNA in un campione. Se presenti verranno
amplificate e quindi rivelabili tramite elettroforesi
altrimenti possono essere considerate assenti. In
campo diagnostico permette di determinare
infezioni virali (esempio retrovirus o virus difficili da
diagnosticare), altri patogeni, presenza di DNA
Clonaggio
di sequenze informazionali (geni o altre
estraneo, ecc.
regioni di DNA), a patto di conoscere le sequenze
delle regioni limitrofe (inizio e fine) per costruire
specifici primers.
Genotipizzazione (DNA fingerprinting)

Genotipizzazione tramite
PCR

ANALISI DELLE STR


Le STR (Short Tandem Repeats) sono sequenze di 2-6 bp ripetute
da 3 a 50 volte che si trovano allinterno di regioni introniche
Sono note anche come DNA microsatellite o simple sequence
repeats (SSRs)

Le STR possono essere amplificate mediante PCR


La regione ripetuta di lunghezza variabile mentre le regioni
adiacenti, dove si legano i primers, sono costanti
Gli individui possono essere omozigoti (i due alleli hanno la stessa
lunghezza) o eterozigoti (i due alleli hanno lunghezze diverse)

Amplificazione di una STR


195
195bp
bp

TCAT
TCATrepeat
repeatunit
unit

170
170bp
bp

Frequenza allelica nelle STR


45
40

TH01 Marker

35
Frequency

30

Caucasians (N=427
Blacks (N=414)
Hispanics (N=414)

25
20
15
10
5
0

9.3

Number of repeats

10

*Proc. Int. Sym. Hum.


ID (Promega) 1997,
p. 34

FBIs CODIS DNA Database

Loci STR del CODIS


TPOX
D3S1358
D8S1179

D5S818
FGA
CSF1PO

TH01
VWA

D7S820

AMEL
D13S317

D16S539

D18S51

D21S11

AMEL

13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions

Analisi comparativa delle STR


Amplificazione contemporanea di pi STR mediante Multiplex PCR
Ridotta probabilit di errori introdotti con la PCR
(Informazione nella lunghezza e non nella sequenza)
Risultati uniformi
Possibilit di analizzare campioni in tracce

Analisi mediante DNA-PAGE o elettroforesi capillare


Rapidit nella separazione

Comparazione e/o identificazione


Lanalisi comparativa di 13
STR permette di ridurre la
probabilit di un random
match fino a 1 su 1012
Disponibilit di
kit commerciali e
apparecchiature dedicate

Human identity testing


Casi forensici analisi comparative tra sospettati e prove

Test di paternit/maternit identificazione padre/madre


Studi storici
Studi su persone scomparse
Disastri di massa identificazione
Military DNA dog tag (alternativa alla piastrina)
Creazione di DNA databases relativi a criminali condannati

Campioni analizzabili
Sangue
Liquido seminale
Saliva
Urine
Capelli
Denti
Ossa
Tessuti

Procedura di analisi

Esempio di un Forensic STR Multipl


AmpFlSTR Profiler Plus
Kit available from PE Biosystems (Foster City, CA)

200 bp

100 bp

300 bp

400 bp

Color Separation

Size Separation

D3
A

D8
D5

vWA

FGA

5-FAM (blue)

D21

D18

D13

D7

JOE (green)
NED (yellow)

GS500-internal lane standard

ROX
(red)

9 STRs amplified along with sex-typing marker amelogenin in a

Human Identity Testing con Multiplex STRs

Two different individuals

AmpFlSTR SGM Plus kit

amelogenin
D19

D3

DNA Size (base pairs)


D8 TH01
VWA D21

D16
D18

D2

FGA
probability of a random
match: ~1 in 3 trillion
amelogenin D3

Results obtained in less than 5


hours with a spot of blood the
size of a pinhead

D19
D8

VWA
TH01

D16
D21
FGA

D18

Simultaneous Analysis of 10 STRs and Gender ID

D2

PCR quantitativa

Amplificazione e quantificazione
di specifici frammenti di DNA
Amplificazione attraverso luso della Polymerase
Chain Reaction o PCR (reazione a catena della
polimerasi)
Quantificazione in tempo reale del DNA amplificato
mediante luso di sonde fluorescenti (molecole in
grado di assorbire la luce e riemetterla ad un
determinato colore)
Linsieme di queste due tecniche prende il nome di
Real-time PCR

In teoria la quantit di DNA


amplificato raddoppia ad ogni
ciclo e il suo quantitativo pu
essere espresso dalla formula
Prodotto (T) = (DNA iniziale) x 2n
(n = numero di cicli)
In realt dopo un certo numero
di cicli la quantit di DNA non
aumenta pi esponenzialmente
(consumo dei substrati, ovvero I
precursori per costruire le
catene di DNA, e inattivazione
dellenzima)

DNA amplificato (scala


log)

Limite della
PCR
Teorico
Reale

Numero di
cicli

Campioni con diverso contenuto


iniziale dello stesso DNA e
sottoposti ad amplificazione
mediante PCR seguiranno delle
cinetiche di amplificazione
differenti

4 unit

1 unit

1/8 di unit

Determinazione del quantitativo


di DNA amplificato

SYBR Green I

Il SYBR Green I
agente fluorescente intercalante
3

3
5

Estensione
3

ID

Taq

ID
ID

Taq

ID

ID

Lettura della fluorescenza

ID

ID

ID

ID

ID

Taq

ID

ID

ID
ID

Taq5
3

DNA amplificato (scala


log)

Come sono quantificati i dati


raccolti dallo strumento?
Reale

Teorico

threshold

Detecto
r

Numero di
ciclo

Una volta determinata la linea di base


(fluorescenza nei primi cicli di
amplificazione), la linea di threshold
viene scelta come il valore di
fluorescenza che statisticamente supera
la linea di base (10 volte la deviazione

Ct : threshold cycle
E il ciclo al quale la fluorescenza relativa al DNA
amplificato supera il valore della linea di threshold.
Il Ct proporzionale al numero di sequenze di DNA
iniziali amplificate con la PCR.

Il Ct proporzionale al
numero di sequenze di
DNA iniziali amplificate
con la PCR.

1 unit
Ct = 25

4 unit
Ct =23

4 units
Ct=23

Valori di Ct
23

1/8 di unit
Ct = 28

25

28

Ct : threshold cycle

Luso di curve di taratura permette anche di determinare il valore


assoluto di specifiche sequenze di DNA nel campione analizzato.

Che cosa la Real-time


PCR?
Si basa sulla determinazione quantitativa e in

tempo reale dei prodotti di amplificazione della


PCR mediante luso di molecole fluorescenti che si
legano al DNA

La Real-time PCR permette di quantificare i livelli

di una specifica molecola di DNA misurando il


numero di cicli (Ct) necessari per ottenere un
quantitativo di prodotto amplificato superiore ad
un determinato livello (threshold)

Applicazioni della Real-time


PCR
Quantificazione precisa di DNA o RNA in

campioni
Stima del numero di copie di un gene (OGM)
Studi di espressione genica
RNA (quantificazione del mRNA)

Quantificazione dellespressione
genica
Tutte le cellule di un organismo contengono

lo stesso DNA (e quindi le stesse informazioni


o geni). Tuttavia non tutti i geni vengono
egualmente espressi (diversit tra cellule)
Ogni gene espresso viene convertito in
mRNA per poi essere tradotto in proteina
Le differenti proteine prodotte in una cellula
ne determinano le specifiche funzioni

E possibile quantificare i livelli di mRNA di

specifici geni mediante la Real-time PCR


LmRNA viene prima convertito in DNA
(cDNA) e poi sequenze specifiche
(corrispondenti a determinati geni)
vengono quantificate mediante la tecnica
E cos possibile identificare e quantificare
geni che vengono diversamente espressi in
determinate cellule o in seguito a
modifiche (trasformazione tumorale)

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