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Sequenziamento
(formic acid)
Principio della
tecnica
3
5
T
primer
3
ddA
ddA
ddA
ddA
5
Nella reazione oltre al dATP
presente anche il ddATP (in
genere in rapporto 1:10).
Quando occasionalmente
viene incorporato il ddATP la
reazione di polimerizzazione
si interrompe e la lunghezza
del frammento mi fornisce la
posizione della base usata
Le molecole di DNA da
sequenziare vengono
sottoposte a quattro differenti
reazioni, in ognuna delle quali
presente un ddNTP.
Le reazioni di sintesi del DNA
vengono innescate da uno
stesso prime opportunamente
marcato per permettere la
migliore visualizzazione dei
frammenti prodotti.
I frammenti prodotti
durante la sintesi vengono
successivamente separati su
gel e, anche in questo caso, la
misura loro lunghezza
identifica la posizione della
base che stata utilizzata
come ddNTP nella reazione di
Sequenziamento automatico
Nelle quattro differenti reazioni di
polimerizzazione, oltre che essere
utilizzati differenti ddNTP, la sintesi del
DNA viene innescata dallo stesso
primer ma marcato con quattro
fluorofori differenti.
Questo permette di distingure i
frammenti che sono terminati dal
ddATP o da un altro ddNTP perch
hanno una fluorescenza differente.
I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e analizzati sullo stesso gel.
La separazione elettroforetica permetter di distinguere i vari frammenti in
base alle dimensioni e lo specifico colore di fluorescenza indicher la base
che si trovava in quella posizione.
Sequenziamento automatico
La PCR
Come
funziona?
Miscela di reazione
3
5
3
5
3
3
3
d.NTPs
5Primers
5
5 5
3
3
5 3
5
3
5
5
Denaturazione
95C
5
3
3
5
5 3
Thermal Stable
DNA Polymerase
3
3
Taq
Estensione
5
3
Annealing
50-65C
5
Taq 5
5
5
3
3
Taq
5
5
Taq
Estensione
72C
17
Genotipizzazione tramite
PCR
TCAT
TCATrepeat
repeatunit
unit
170
170bp
bp
TH01 Marker
35
Frequency
30
Caucasians (N=427
Blacks (N=414)
Hispanics (N=414)
25
20
15
10
5
0
9.3
Number of repeats
10
D5S818
FGA
CSF1PO
TH01
VWA
D7S820
AMEL
D13S317
D16S539
D18S51
D21S11
AMEL
Campioni analizzabili
Sangue
Liquido seminale
Saliva
Urine
Capelli
Denti
Ossa
Tessuti
Procedura di analisi
200 bp
100 bp
300 bp
400 bp
Color Separation
Size Separation
D3
A
D8
D5
vWA
FGA
5-FAM (blue)
D21
D18
D13
D7
JOE (green)
NED (yellow)
ROX
(red)
amelogenin
D19
D3
D16
D18
D2
FGA
probability of a random
match: ~1 in 3 trillion
amelogenin D3
D19
D8
VWA
TH01
D16
D21
FGA
D18
D2
PCR quantitativa
Amplificazione e quantificazione
di specifici frammenti di DNA
Amplificazione attraverso luso della Polymerase
Chain Reaction o PCR (reazione a catena della
polimerasi)
Quantificazione in tempo reale del DNA amplificato
mediante luso di sonde fluorescenti (molecole in
grado di assorbire la luce e riemetterla ad un
determinato colore)
Linsieme di queste due tecniche prende il nome di
Real-time PCR
Limite della
PCR
Teorico
Reale
Numero di
cicli
4 unit
1 unit
1/8 di unit
SYBR Green I
Il SYBR Green I
agente fluorescente intercalante
3
3
5
Estensione
3
ID
Taq
ID
ID
Taq
ID
ID
ID
ID
ID
ID
ID
Taq
ID
ID
ID
ID
Taq5
3
Teorico
threshold
Detecto
r
Numero di
ciclo
Ct : threshold cycle
E il ciclo al quale la fluorescenza relativa al DNA
amplificato supera il valore della linea di threshold.
Il Ct proporzionale al numero di sequenze di DNA
iniziali amplificate con la PCR.
Il Ct proporzionale al
numero di sequenze di
DNA iniziali amplificate
con la PCR.
1 unit
Ct = 25
4 unit
Ct =23
4 units
Ct=23
Valori di Ct
23
1/8 di unit
Ct = 28
25
28
Ct : threshold cycle
campioni
Stima del numero di copie di un gene (OGM)
Studi di espressione genica
RNA (quantificazione del mRNA)
Quantificazione dellespressione
genica
Tutte le cellule di un organismo contengono